子宫内膜雌激素受体β基因多态性及表达与原因不明月经过少关系的探讨

摘要

每周期月经总量少于30ml，称为月经过少，是妇科较常见症状。月经量多少除了受子宫内膜影响外，雌激素是调节月经的主要激素。临床上导致月经过少的原因大体分为：①内分泌因素，如各种激素分泌异常等。体内雌激素水平较低，使子宫内膜增生不足，出现子宫内膜菲薄。②子宫内膜本身因素。 我们临床发现有些月经过少患者行宫腔镜检查，发现不少患者的子宫内膜仅表现为生长不良，检测激素水平在正常范围，激素替代治疗无效，且排除内外科及先无性疾病，我们称之为原因不明月经过少。这类患者常因受精卵不易在子宫内膜种植，导致反复流产、不孕。用辅助生殖技术的成功率极低，即使妊娠成功，也极易流产，严重影响了患者的身心健康。对此类患者的治疗，己成为目前临床上十分棘手的问题。 雌激素主要通过与雌激素受体(estrogen receptor，ER)结合而发挥其生物学效应。作用体现在以下两个方面：①促进子宫内膜的增生修复；②促进子宫内膜血管的周期性重建。原因不明月经过少病人雌激素水平正常，是否雌激素受体环节出现障碍?我们前期实验采用免疫组化法检测子宫内膜雌激素受体，发现原因不明月经过少患者ER表达较月经量正常妇女明显减少。 ER分ERα和ERβ两个亚型。本课题组通过实验发现ERα基因多态性与原因不明月经过少相关。在ERβ基因有多种多态性位点存在，其中ERβ基因5号外显子Rsa I和8号外显子3’非编码区Alu I多态性位点研究较多。在ERβ基因5号内含子(启动子区)存在C(cytosine)和A(adenine)重复多态性(D14S1026)，它属于基因的调控区，对基因表达起调控作用。不同CA重复次数与某些激素水平相关疾病有关。NilssonM认为ER基因多态性(gene polymorphisms)可能引起基因在转录、翻译水平失调，导致ER表达、功能异常。 目前对雌激素受体基因多态性与妇科激素依赖性疾病相关性的研究较多，如：卵巢功能障碍、子宫内膜癌、绝经后骨质疏松、子宫内膜异位症等。到目前为止，国内外尚无雌激素受体β基因多态性与原因不明月经过少关系的研究报道。本课题研究原因不明月经过少患者ERβ基因多态性及其表达，探讨原因不明月经过少的发病机制，为进一步深入研究和治疗提供理论依据。 第一部分雌激素受体β基因Rsa I、Alu I多态性与原因不明月经过少的关系目的：探讨重庆地区雌激素受体β基因Rsa I、Alu I多态性与原因不明月经过少的关系。 方法：选择重庆地区100名原因不明月经过少患者为实验组，100名月经量正常妇女作为对照组。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphisms,PCR-RFLP)的方法分析ERβ基因Rsa I、Alu I多态性。观察ERβ基因多态性在实验组与对照组中的分布，分析各基因型、等位基因型及单倍体型特征，比较ERβ基因各基因型与年龄、人流次数等指标的关系。结果：实验组ERβ基因RsaI基因型RR,Rr,rr频率与对照组相比差异没有显著性(χ2=8.376,P=0.068)。R等位基因型频率实验组为37.5％，对照组为48.5％,OR值：0.642(95％CI=0.421～0.973)，P=0.026；A等位基因型频率实验组为18.0％，对照组为11.5％,OR值：1.689(95％CI=0.960～2.971)，P=0.067。RRaa单倍体型OR值：0.049(95％CI=0.006～0.378)，P＜0.001。两组ERβ基因不同基因型年龄、人流次数比较，差别无统计学意义。 结论：ERβ基因多态性与原因不明月经过少有关，R等位基因可能是其保护因素。RRaa单倍体型可能是原因不明月经过少潜在保护因素。原因不明月经过少患者ERβ基因RsaI和AluI基因型与年龄、人流次数无相关性。 第二部分雌激素受体β基因CA重复序列多态性与原因不明月经过少的关系目的：探讨重庆地区雌激素受体β基因CA二核苷酸重复序列多态性与原因不明月经过少的关系。 方法：选择重庆地区的100名原因不明月经过少患者为实验组，100名月经量正常妇女作为对照组。对雌激素受体基因β5号内含子的高变区二核苷酸(CA)重复序列进行纯化、克隆和序列分析。观察CA重复序列多态性在实验组与对照组中的分布情况，将CA重复序列多态性与年龄、人流次数等指标进行比较。 结果：共分离出CA重复数目为16～24的9种等位基因。对照组和实验组的CA重复序列等位基因的分布频率不同，差异无显著性(x2=7.155,p=0.520)。以重复次数n≤20作为SS型，n＞20为LL型。SS基因型频率实验组为66％，对照组为51％，OR值：1.865倍(95％CI=1.055～3.298)。再比较两组病人SS型和LL等位基因型的分布频率，差异有显著性(X2=4.634,P=0.031)。ERβ基因CA-STR、RsaI和AluI单倍体型连锁不平衡性不强。原因不明月经过少患者ERβ基因不同CA等位基因型的年龄和人流次数差别均无统计学意义。 结论：ERβ基因CA重复序列多态性与原因不明月经过少有关,SS型等位基因型可能是原因不明月经过少的危险因素。原因不明月经过少患者ERβ基因的不同CA等位基因型与患者的年龄及人流次数无相关性。 目的：通过比较ERβ在原因不明月经过少患者和月经量正常妇女子宫内膜组织中的表达，探讨ERβ在原因不明月经过少的发生、发展中作用。 方法：从上述两组人群中分别选取原因不明月经过少患者子宫内膜组织40例，月经量正常妇女子宫内膜组织40例。通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)，计算机图象分析，半定量研究雌激素受体β的mRNA表达；用Western印迹法半定量检测雌激素受体β蛋白在子宫内膜组织中的表达，分析实验组与对照组ERβmRNA及蛋白质的表达情况。将年龄、人流次数、ERβ基因的各基因型、等位基因型与子宫内膜ERβmRNA及蛋白质的表达之间分别进行比较。 结果：实验组ERβmRNA表达量为0.6457±0.2957，对照组为0.9637±0.3621，实验组ERβ-mRNA比对照组表达下调，差异有统计学意义(t=-6.589,P＜0.001)。实验组ERβ蛋白质表达量为347.37±30.35，对照组为445.21±45.67，实验组ERβ蛋白质比对照组表达下调，差异有统计学意义(t=-4.353,p＜0.001)。两组人群不同年龄、人流次数ERβ表达比较，差别无统计学意义。两组RsaI基因型、AluI基因型、CA重复序列基因型ERβ表达差异均无统计学意义。 结论：原因不明月经过少患者ERβmRNA及蛋白质在子宫内膜中的表达低于月经量正常妇女，可能与原因不明月经过少患者月经量减少有关。原因不明月经过少患者子宫内膜ERβ的表达与年龄、人流次数无相关性。两组人群不同RsaI、AluI、CA重复序列基因型子宫内膜ERβ基因表达无差异。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

前言

第一部分雌激素受体β基因RsaI、AluI多态性与原因不明月经过少的关系

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分雌激素受体β基因CA重复序列多态性与原因不明月经过少的关系

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第三部分原因不明月经过少子宫内膜雌激素受体β表达

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

文献综述一：人短串联重复序列及应用

文献综述二：雌激素受体基因多态性与妇产科疾病关系的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的论文及申报的科研项目