MASPIN真核表达载体的构建及对胃癌细胞SGC7901凋亡与增殖的影响

摘要

目的： 1.构建MASPIN基因真核表达载体，转染至胃癌细胞株SGC7901，检测其对SGC7901细胞MASPIN表达的影响。 2.检测转染MASPIN对胃癌细胞SGC7901细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。 3.检测凋亡相关基因Bax/Bcl-2基因表达变化，探讨过表达MASPIN诱导胃癌细胞凋亡的机制。 方法： 1.RT-PCR扩增MASPIN基因全长，载体PCR2.1用HindⅢ/XbaⅠ双酶切，二者用T4连接酶构建MASPIN/PCR2.1表达载体，转染胃癌细胞株SGC7901。 2.琼脂糖凝胶电泳检测凋亡特征性DNA梯形带。 3.采用AmexinV-FIFC/PI方法检测转染前后、使用凋亡诱导剂TRATL(50ng/ml)前后凋亡率变化。 4.RT-PCR和Western bolt检测MASPlN基因、Bax/Bcl-2基因表达变化。 5.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞术(FCM)，检测过表达MASPIN对SGC7901细胞增殖及细胞周期的影响。结果： 1.酶切证实成功构建真核表达质粒MASPIN/PCR2.1；转染重组质粒组MASPIN mRNA(33.624±1.2)和蛋白水平(23.36±1.6)的表达明显高于未处理组(13.72±2.0、12.01±1.3)和空质粒组(15.01±1.5、12.324±1.5，P＜0.05)。 2.凝胶电泳观察到特征性凋亡梯带。 3.各组细胞均有凋亡率的增加且呈时间依赖性：转染重组质粒/TRAIL作用组最高，12h、24h、48h分别达到8.0％、16.3％、25.8％，转染重组质粒组为3.0％、8.2％、14.4％，TRAIL作用组为4.1％、9.8％、15.9％(P＜0.05)。 4.48h转染重组质粒/TRAIL组Bax mRNA和蛋白表达(55.324±1.4、75.384±1.3)高于转染重组质粒组(34.324±1.2、40.674±1.8)和TRAIL作用组(43.25±1.8、36.18±1.3，P＜0.05)；三组Bc1-2 mRNA表达为28.334±2.5、34.31±1.2、32.84±2.1(P＜0.05)，蛋白表达为17.43±1.5、45.11±2.1、42.84±1.5(P＜0.05)。 5.流式细胞仪检测显示和与转染空载体组相比，过表达MASPIN的SGC7901细胞G0/G1期百分比增高(70.3％vs55.6％)，S期细胞减少(19.8％VS 34.9％，P＜0.05)。 6.MTT实验显示，转染MASPIN/PCR2.1组细胞增殖随时间延长而减慢，第12h、24h、48h、72h的细胞增殖率分别为0.98％、6.93％、18.03％和33.5％，明显低于转染空载体组0.04％、3.01％、4.21％、4.41％(P＜0.05)。结论： 1.成功构建MASPIN/PCR2.1表达载体。转染胃癌细胞株SGC7901后上调了MASIPIN基因在mRNA和蛋白水平表达。 4.过表达MASPIN能诱导SGC7901细胞发生凋亡并显著增加胃癌细胞对凋亡刺激信号的敏感性，时间越长效应越显著。其机制可能通过上调Bax，下调Bcl-2基因的表达诱导胃癌细胞凋亡。 5.过表达MASPIN能诱导SGC7901细胞发生增殖抑制和G0/G1期阻滞。

目录

论文说明：英汉缩略词名词对照

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摘要

前言

1材料和方法

2实验结果

3讨论

附图

参考文献

综述文献Maspin在胃癌中的作用研究进展

致谢

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