普萘洛尔对映异构体的立体选择性分析与GBLP功能研究

摘要

目的 通过普萘洛尔(Propranolol，Pro)对映异构体(R-Pro、S-Pro)在Caco-2细胞单层模型上的吸收转运研究，R-Pro、S-Pro诱导Caco-2、HepG-2和HUVEC细胞后的差异表达蛋白质的比较研究，以及对GBLP进行的功能研究，在蛋白质水平进一步阐明普萘洛尔手性选择性的生物学特征，为探讨β1β2受体阻断剂对映异构体立体选择性的作用机制提供新的实验依据。 策略与方法 1.Caco-2细胞单层模型的建立：将Caco-2细胞接种于Transwell的聚碳酸脂膜上，培养到21～25天时，通过测定跨膜电阻(TEER法)、表观渗透系数(荧光黄测定法)和形态学观察(扫描电镜和透射电镜)对细胞单层的完整性和稳定性进行评估。 2.R-Pro和S-Pro吸收转运实验：用R-Pro和S-Pro分别处理Caco-2细胞单层，运用高效液相色谱法测定细胞单层膜两侧的药物浓度，评价其吸收转运方式。 3.运用比较蛋白质组分析R-Pro、S-Pro分别作用于Caco-2、HepG-2和HUVEC细胞后的差异表达蛋白谱。提取两种对映异构体作用于三种细胞后全细胞蛋白质，对三组细胞蛋白质进行双向电泳分离。通过优化各种条件参数来确定合适的上样量和染色方法。用PDQuet(7.4.0)软件对扫描的二维凝胶电泳图谱时行分析，筛选出各组细胞中的差异表达蛋白斑点。候选差异蛋白斑点经胶内胰酶酶解后进行MALDI-TOF-MS分析，对得到的肽质量指纹图谱(peptide massfingerprinting,PMF)使用Mascot软件在SwissProt数据库中检索鉴定差异表达蛋白质。 4.对筛选出的差异表达蛋白GBLP用Western blot法和激光共聚焦检测GBLP在R-Pro、S-Pro诱导HUVEC细胞后的表达情况及细胞内定位。 5.GBLP相互作用蛋白质的筛选：提取R-Pro和S-Pro作用HUVEC后的细胞与对照细胞中的蛋白质，用免疫沉淀方法分离与GBLP可以存在相互作用的蛋白质；用LC-ESI-MS/MS技术对分离得到的蛋白质进行鉴定。 结果 1.本课题建立的Caco-2细胞单层模型，形态学检查可观察到细胞融合成连续而完整的单细胞层，细胞间连接紧密，细胞表面覆盖一层刷状缘微绒毛，垂直于细胞表面，并且细胞具有不对称性，这些形态与小肠上皮细胞相似；培养21天后测得的细胞单层的荧光黄通透系数Papp(1.0×10 -6cm/s，跨膜电阻TEER)200(Ω*cm2)，说明细胞单层完整性好；建立好的Caco-2细胞单层模型在Hank平衡盐溶液(HBSS)中培养8h内，Papp值小于1.0×10 -6(cm/s)，TEER值大于200(Ω*cm2)，说明细胞单层模型稳定性好。 2.累积2h普萘洛尔对映异构体的表观通透系数的结果显示，在20-240μmol/L的浓度范围内测得的Papp值，无论对于R-Pro，还是S-Pro，Papp值变化微小，均无显著性差异。 3.通过优化条件，最终确定合适的样品上样量为100μg、染色方法为银染。通过分别对R-Pro和S-Pro作用Caco-2、HepG-2和HUVEC后的二维凝胶电泳图谱进行分析，分别发现约有25个、30个和36个蛋白斑点表达有差异，对其中25个、15个和18个差异蛋白斑点进行MALDI-TOF-MS分析后，分别鉴定出了8种、4种和10种可能的差异表达蛋白。 4.激光共聚焦及Western blot检测结果均表明：GBLP在S-Pro作用后的HUVEC细胞中表达明显低于R-Pro作用后。GBLP定位于细胞质膜与胞浆中。 5.用免疫共沉淀方法在R-Pro和S-Pro作用HUVEC实验组与对照组细胞中都共分离到了8条蛋白条带；质谱鉴定出了这些条带中的9个蛋白，其中7个蛋白可能为GBLP相互作用蛋白，分别为： Caseinalpha-S1、Casein alpha-S1、Beta casein、Desmoglein 1 precursor、Alphaenolase、Peroxiredoxin 2与Fructose-bisphosphate aldolase C结论1.普萘洛尔属于高通量药物，主要为被动吸收，R-Pro与S-Pro两个对映异构体在吸收转运方面不存在立体选择性。 2.鉴定出的差异表达蛋白可能在R-Pro与S-Pro手性生物学特征的发生机制中起有重要作用。 3.GBLP在R-Pro与S-Pro处理HUVEC细胞后的表达存在明显差异，根据生物信息学搜索结果，推测：(1)GBLP可能参与了R-Pro与S-Pro手性生物学效应的信号转导通路；(2)GBLP可能是G蛋白信号转导通路中的重要调节蛋白；(3)GBLP可能是一个潜在的新的药物作用靶点。 4.鉴定出了7个可能与GBLP存在相互作用的蛋白。这些蛋白的生物物信息学搜索结果提示，GBLP可能参与了细胞的能量代谢调节和抗氧化机制，这与普萘洛尔的生物学效应发生机制密切相关。

目录

论文说明:英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前言

第一部分 R-Pro和S-Pro对映异构体在Caco-2细胞模型上的吸收转运

1材料与方法

2结果

3.讨论

小结

参考文献

第二部分 R-Pro和S-Pro诱导吸收、代谢和靶细胞的比较蛋白质组分析

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

第三部分 GBLP在HUVEC细胞中差异表达的验证

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

第四部分 免疫共沉淀研究GBLP相互作用蛋白

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

全文总结

本课题的创新之处

本课题的不足之处与后续研究

文献综述 β肾上腺素受体阻滞剂药代动力学和药效学立体选择性研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文