PPAR在人胶质瘤细胞SWO-38中诱导分化作用机制的研究

摘要

目的： 了解PPARγ蛋白在人胶质瘤组织和细胞株中的表达，观察CDA-2对人胶质瘤细胞SWO-38 PPARγ蛋白表达的影响和对SWO-38细胞的诱导分化作用，并进一步探讨PPARγ在胶质瘤诱导分化中的作用机制，为胶质瘤诱导分化治疗提供治疗靶点，同时也为发展新的分化诱导剂提供靶标和科学依据。 方法： 1.应用免疫组化检测40例胶质瘤组织中PPARγ蛋白表达；RT-PCR和western blot检测人胶质瘤细胞SWO-38、U251和SHG-44中PPARγ mRNA和蛋白表达；western blot检测三株胶质瘤细胞GFAP蛋白表达。 2.Western blot检测罗格列酮、ATRA和CDA-2在不同剂量和不同作用时间对SWO-38细胞PPARγ蛋白表达的影响；RT-PCR进一步了解CDA-2对SWO-38细胞PPARγ mRNA表达的调节；免疫组化CDA-2对PPARγ蛋白亚细胞定位的影响。 3.MTT、集落形成实验检测CDA-2对SWO-38细胞活性及增殖能力的影响：FCM进一步了解CDA-2对SWO-38细胞周期的影响；HE染色、免疫组化和western blot从细胞形态和GFAP蛋白表达等方面检测CDA-2对SWO-38细胞的诱导分化作用。 4.PPARγ抑制剂GW9662预处理细胞后，通过MTT、集落形成实验、FCM和western blot等方法检测SWO-38细胞在细胞活性、增殖能力、细胞周期和GFAP蛋白表达等方面的变化，了解CDA-2对SWO-38细胞的增殖抑制和诱导分化作用与PPARγ之间的关系。同时，western blot检测CDA-2诱导SWO-38细胞分化过程中PTEN(p-PTEN)和COX-2蛋白的表达； GW9662预处理细胞阻断PPARγ活化，western blot进一步检测SWO-38细胞PTEN(p-PTEN)和COX-2蛋白在对照组(DMSO+CDA-2)和抑制剂组(GW9662+CDA-2)的表达，探讨PPARγ在CDA-2诱导SWO-38细胞分化中的作用机制。 结果： 1.PPARγ在胶质瘤组织中阳性表达率仅为37.5％，在瘤旁脑组织中的阳性表达率为76.9％，二者间差异有显著意义(p＜0.05)；PPARγ表达与胶质瘤分化程度无明显相关l生(p＞0.05)；PPARγmRNA和蛋白在SWO-38和U251细胞均有中表达，而SHG-44细胞中无表达；GFAP蛋白在SHG-44细胞中表达明显高于SWO-38和U251细胞(p＜0.05)。 2.Western blot结果提示罗格列酮、ATRA和CDA-2均可促进SWO-38细胞PPARγ蛋白表达，CDA-2 3mg/ml作用3h即可明显促进细胞PPARγ蛋白表达；RT-PCR结果则表明CDA-2可促进SWO-38细胞PPARγmRNA表达；免疫组化检测结果显示对照组PPARγ蛋白在细胞质和细胞核中均有表达，CDA-2处理组PPARγ蛋白主要表达于胞核，即PPARγ蛋白出现核转位。 3.MTT和集落形成实验结果提示CDA-2抑制SWO-38细胞活性和增殖能力，中效抑制浓度(IC50)分别为2.33±0.37mg/ml和0.51+0.01mg/ml，其抑制作用呈时间和剂量依赖性增强；细胞周期检测提示在CDA-2作用下，G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，提示G1期阻滞；HE染色结果显示CDA-2 3mg/ml作用72h后SWO-38细胞胞体增大，核/浆比例减小，细胞突起增多变长；免疫组化和western blot显示细胞GFAP蛋白表达增强，瘤细胞表现出向成熟胶质细胞分化表型。 4.PPARγ抑制剂GW9662预处理SWO-38细胞后，与对照组(DMSO+CDA-2组)相比，MTT结果显示抑制剂组CDA-2对细胞的抑制作用减弱，二者的IC50分别为2.46±0.16mg/ml及1.79±0.18mg/ml(P＜0.05)；集落形成实验结果显示抑制剂组CDA-2对细胞克隆形成的抑制作用下降(P＜0.05)；FCM显示抑制剂组S期细胞增多(P＜0.05)；western blot结果提示抑制剂组GFAP蛋白表达较对照组明显下降(P＜0.05)，提示CDA-2对SWO-38细胞的增殖抑制和诱导分化作用与PPARγ有关。同时，western blot结果亦表明CDA-2可促进SWO-38细胞PTEN(p-PTEN)蛋白表达而抑制COX-2蛋白表达；Western blot进一步证实CDA-2对SWO-38细胞PTEN(p-PTEN)和COX-2蛋白表达的调控作用可部分被GW9662逆转，提示CDA-2对SWO-38细胞PTEN(p-PTEN)和COX-2蛋白的调控作用与PPARy有关。 结论： 1.PPARγ与胶质瘤的发生相关，可为胶质瘤治疗提供新的靶点。2.CDA-2可上调SWO-38细胞中PPARγ蛋白表达，同时促进其核转位，提示CDA-2可活化PPARY蛋白。 3.CDA-2在体外实验中显示对SWO-38细胞的增殖抑制和周期阻滞作用；同时，CDA-2诱导SWO-38细胞趋于成熟分化，是一种良好的诱导分化剂。 4.CDA-2对SWO-38细胞的增殖抑制和诱导分化作用与PPARγ信号通路有关。PPARγ通过对PTEN(p-PTEN)、COX-2和GFAP等基因表达的调控参与胶质瘤的诱导分化。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

摘要

前言

第一部分:PPARγ在胶质瘤中的表达及意义

1材料与方法

2结果

3讨论

附图

参考文献

第二部分:罗格列酮、ATRA和CDA-2促进胶质瘤细胞SWO-38PPARγ表达

1材料与方法

2结果

3讨论

附图

参考文献

第三部分:CDA-2诱导人胶质瘤细胞SWO-38分化并抑制其增殖的作用

1材料与方法

2.结果

3讨论

附图

参考文献

第四部分:PPARγ诱导人脑胶质瘤细胞SWO-38分化的机制研究

1材料与方法

2结果

3讨论

附图

参考文献

全文总结

本课题的创新点、存在的问题和展望

文献综述一 PPARγ及其抗肿瘤作用

文献综述二 胶质瘤诱导分化研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的论文和标书撰写