RNA干扰沉默STAT3基因对肝癌HepG2及SMMC-7721细胞株的影响研究

摘要

肝细胞癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤之一，其发生、发展过程受诸多因素的影响。传统的放疗、化疗及手术治疗手段仍不能获得理想治疗效果。为此，基因治疗成为目前肝癌的研究热点。信号转导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)是研究干扰素诱导基因转录时首次鉴定的一个胞浆蛋白家族。研究发现，STATs具有强烈的抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用，参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演变，其中以STAT3尤为活跃。STAT3信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，该通路持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化，目前已被定义为癌基因。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年发现的一种重要的转录后水平的基因沉默方式。它能触发某种转录后监控程序，导致特定mRNA单链的降解。本实验利用RNAi技术，设计短发夹样RNA(small hairpin RNA，shRNA)并构建靶向STAT3的shRNA-DNA质粒，筛选稳定表达小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的肝癌HepG2及SMMC-7721细胞株，体外研究siRNA稳定和特异性诱导肝癌STAT3基因转录后沉默并逆转其恶性表型的能力，探索肝癌治疗新方法。 目的：探讨应用RNAi技术沉默信号转导子与转录活化子(STAT3)基因对肝癌HepG2及SMMC-7721细胞的影响。 方法：针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板，通过定向克隆至质粒pGenesil-1，构建靶向抑制STAT3基因表达的短发夹双链RNA(shRNA)真核表达载体pGenesil-1-shRNA-STAT3，将其转化DH5α大肠杆菌，提取质粒进行酶切鉴定和测序分析；将鉴定正确的重组表达质粒用脂质体LipofactaminTM2000转染人肝癌细胞HepG2及SMMC-7721细胞。通过半定量RT-PCR、Western blot检测STAT3基因mRNA和蛋白水平的表达情况，采用MTT实验、流式细胞术检测转染后细胞增殖及细胞周期的变化。 结果：成功构建了pGeneSil 1.0-shRNA-STAT3重组质粒，并转染HepG2及SMMC-7721肝癌细胞；半定量RT-PCR、Western blot结果显示，重组质粒转染组细胞的STAT3基因的mRNA及蛋白表达水平显著低于对照组；MTT实验、流式细胞术检测结果显示，重组质粒转染组细胞的增殖明显抑制，S期细胞显著减少，G0-G1期细胞显著增加，并出现凋亡现象。 结论：pGeneSil 1.0-shRNA-STAT3转染HepG2及SMMC-7721 肝癌细胞后，可有效抑制STAT3的表达，并抑制肝癌细胞的生长及增殖，促进癌细胞凋亡，为肿瘤基因治疗的RNAi策略提供了实验依据。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前 言

第一部分：构建靶向抑制STAT3基因的shRNA重组表达载体

1.材料与方法

2.结 果

3.讨论

参考文献

第二部分：pGenesil-1-shRNA-STAT3抑制肝癌细胞STAT3基因表达的实验研究

1.材料与方法

2.结 果

3.讨 论

参考文献

全文总结

文献综述：STAT3基因与肿瘤的基因治疗

致 谢

攻读学位期间发表文章及参与课题研究