CD82/KAI1基因在假孕及延迟着床小鼠子宫的表达及功能研究

摘要

目的：胚胎着床是胎生哺乳动物及人类生殖生理的重要环节，胚胎着床的关键步骤是胚胎滋养层细胞对子宫内膜的侵入，进而与母体成分形成胎盘。比较发现，滋养层细胞的侵入特性与肿瘤细胞的侵袭特性十分相似。CD82/KAI l基因是一种肿瘤转移抑制基因，在抑制多种肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。已有研究表明，CD82/KAI l在妊娠小鼠子宫中规律表达。为进一步了解CD82/KAIl在胚胎植入过程中的作用，本文采用RT-PCR、免疫组织化学、胚胎体外培养及抗体宫角注射等方法探讨CD82/KAI 1在假孕和延迟着床小鼠子宫及植入前胚胎中的表达规律，为阐明胚胎着床的分子机理补充新的资料。 方法：1.假孕小鼠模型的建立：清洁级昆明雄鼠(6-8周)行输精管结扎术，休息两周后与性成熟雌鼠交配获得假孕雌鼠。取假孕D1-8雌鼠子宫提取总RNA及制作冰冻切片分别检测假孕小鼠子宫中CD82/KAIl mRNA及蛋白质的表达情况。2.延迟着床小鼠模型的建立：性成熟清洁级昆明雌雄鼠交配获得妊娠雌鼠，于妊娠D4上午手术摘除孕鼠双侧卵巢，分别于妊娠D5、D6上午给切除卵巢的小鼠皮下注射孕酮0.1ml(10mg/ml)，妊娠D7将小鼠随机分为两组：一组为延迟着床组，皮下注射孕酮0.1ml(10mg/ml)：另一组为延迟着床激活组，皮下注射孕酮0.1 ml(10mg/ml)和雌二醇0.1 ml(1μg/ml)。分别于妊娠D5、D6、D7、D8上午，颈椎脱臼法处死延迟着床组小鼠，将一侧子宫角取材，另一侧子宫角用生理盐水冲洗，检查是否有延迟着床的胚胎，成功的延迟着床模型应能够检测到延迟着床的胚胎。延迟着床激活组小鼠于妊娠D8，尾静脉注射1.0％台盼蓝溶液，检查是否有胚胎着床位点，成功的延迟着床激活处理在注射台盼蓝溶液后肉眼能够看到子宫角上有着床位点。将收集的延迟着床及延迟着床激活小鼠子宫组织置于液氮中，用于总RNA的提取和冰冻切片，检测CD82/KAI1mRNA及蛋白质的表达情况。3.性成熟清洁级昆明雌鼠用孕马血清促性腺激素(PMSG)和绒毛膜促性腺激素(hCG)超排后，与成熟雄鼠交配，在妊娠D1-4分别脱臼处死小鼠，剪取双侧输卵管(D1-3)和子宫(D4)，用DMEM/Ham’s F12冲洗输卵管和子宫，收集2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚及囊胚期胚胎，用于提取胚胎总RNA及胚胎免疫荧光，检测CD82/KAI1 mRNA及蛋白质的表达。4.将8-细胞小鼠胚胎培养于含不同浓度CD82/KAI1抗体的培养液中，观察囊胚形成数、囊胚孵出数及囊胚细胞数。5.妊娠D4小鼠宫角注射CD82/KAI1抗体，于妊娠D8观察小鼠胚胎植入数量。结果：1.CD82/KAI1 mRNA在假孕D1-8小鼠子宫中均有表达，于D4、D5表达最丰富.CD82/KAI1蛋白在假孕D1-8的子宫基质细胞及腺上皮细胞均有表达，假孕D1-4腔上皮细胞无表达，假孕D5，子宫腔上皮细胞出现弱阳性表达，从D6开始子宫腔上皮细胞表达逐渐增强。2.在延迟着床模型小鼠子宫中，CD82/KAI1 mRNA的表达从D4到D8呈显著下降趋势，在雌二醇激活后mRNA的表达上升(P＜0.05)，CD82/KAI1蛋白在D5弱表达于上皮下基质细胞，在D6-8无明显表达，在雌二醇激活后蛋白明显表达于上皮下基质细胞的胞膜和胞浆。3.CD82/KAI1 mRNA在小鼠不同时期胚胎中均有表达，在桑葚胚及囊胚期的表达显著高于其他时期(P＜0.05)，CD82/KAI1蛋白表达于各时期胚胎细胞的细胞浆和细胞膜，在桑葚胚期CD82/KAI1蛋白还强表达于胚胎细胞的胞核。4.一定浓度的CD82/KAIl抗体可明显抑制囊胚的形成(1:400，P＜0.05)和脱带(1:800，P＜0.05)，随着抗体浓度的增加，抑制作用越明显。5.宫角注射一定量的CD82/KAI1抗体可以显著提高小鼠胚胎的着床数(8.35±0.1 7 vs 4.52±0.24.P＜0.05)。结论：1.CD82/KAI1 mRNA及蛋白质在假孕D1-8小鼠子宫中均有表达，说明其表达是非胚胎依赖性的。2.CD82/KAI1在小鼠子宫中的表达可能受雌激素的调节。3.CD82/KAI1基因能够促进小鼠胚胎的体外发育和抑制胚胎着床，其具体的作用机制需要进一步的探讨。

目录

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摘要

前言

第一部分CD82／KAI1在假孕小鼠子宫的表达规律及作用探讨

1材料和方法

2结果

3讨论

第二部分CD82KAI1在延迟着床小鼠子宫的表达规律及作用探讨

1材料和方法

2结果

3讨论

第三部分CD82／KAI1在小鼠胚胎的表达及对胚胎植入的调节

1材料和方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述 肿瘤转移抑制基因CD82/KAI1的研究进展

致 谢

攻读硕士期间发表文章及参加会议