磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)对乙型肝炎病毒表面抗原表达的影响

摘要

对大多数在宿主细胞核内复制的病毒来说，病毒RNA输出（RNAexport）是其基因转录后调节的重要步骤之一。1993年在HBV基因组上发现的一个片段（1151nt-1684nt）被定义为乙型肝炎病毒（HBV）转录后调节元件PRE（HBVpost-transcriptionalregulatoryelement，HPRE）。现有的研究认为其具有辅助转录产物从细胞核向细胞浆运输的功能，但机制尚未清楚。Zang等人用带电泳迁移率变动分析（EMSA）发现两种细胞蛋白能够与HPRE相互作用，其中一个35kDa的蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。但GAPDH如何影响HBV的复制和表达，目前还没有具体报道。本实验的研究目的在于从体外验证GAPDH与HPRE-RNA的结合作用，利用检测系统pDM138-HPRE探讨GAPDH在HPRE转录后调节的作用，然后过量表达GAPDH于HepG22.2.15细胞和瞬时表达HBs的细胞中，检测HBs表达量来阐明GAPDH在HBV的转录后调节机制中的功能。 主要研究方法和研究结果： 1.用线性化pGEM-HPRE质粒作为模板，在Biotion标记的碱基体系中用T7RNA聚合酶，以体外转录的方法合成HPRE-BiotinRNA。在BL21（DE3）细菌里诱导大量表达重组体pET32a（+）-GAPDH的GAPDH-His蛋白，获得大量56KDa的蛋白，再采用Ni2+-NTA树脂亲和纯化，以SDS-PAGE进行初步鉴定，并以兔抗人GAPDH和抗His标签抗体来进行Westernblot蛋白鉴定。 2.利用M-280Streptavidin磁珠和Biotin的特异性结合，可用磁力座分离复合物的特性，将洗涤后的沉淀复合物做WesternBlot鉴定。用抗His和抗GAPDH单克隆抗体检测，实验组GAPDH-His+HPRE-BiotinRNA能形成复合物，可鉴定出目的蛋白条带，而对照组His+HPRE-BiotinRNA则没有条带出现。由此证明GAPDH-His蛋白能够与HPRERNA结合。 3.将表达人类GAPDH基因的真核表达质粒pcDNA3.1（+）-GAPDH，与含CAT报告基因的pDM138及pDM138-HPRE和表达绿色荧光蛋白（GFP）的pEGFP-N1分组共转染293T细胞，转染48小时后通过流式细胞仪测定pEGFP-N1表达的GFP，来评估转染效率。用ELISA方法检测报告基因CAT的表达来验证蛋白GAPDH对HPRE功能的影响。报告基因CAT表达量经统计学分析显示：转染质粒pDM138-HPRE的细胞CAT表达明显增加；而共转染质粒pDM138-HPRE和pcDNA3.1（+）-GAPDH，CAT的表达受到明显抑制（p<0.05）。 4.将GAPDH蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1（+）-GAPDH转染于HepG22.2.15细胞和瞬时表达HBs的293T细胞中，通过ELISA检测HBs的表达量。应用统计学分析显示：GAPDH蛋白在HepG22.2.15中过度表达对HBs的表达有明显的抑制作用（p<0.05）。通过对比pcDNA3.1（+）-HBs与pcDNA3.1（+）-HBs-HPRE的实验结果，证实GAPDH蛋白对HBs表达的抑制作用是通过HPRE来发挥的。 结论：GAPDH和HPRERNA能够在体外结合，并且GAPDH是HPRE的抑制性蛋白，能通过HPRE来调节HBs抗原的表达。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

第一部分体外验证HPRE RNA和GAPDH蛋白的结合作用

前言

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1 GAPDH-His的构建、表达和纯化[1]

2.2 Western Blot鉴定

2.3体外结合实验Western blot鉴定结果

3讨论

参考文献

第二部分GAPDH对HPRE功能的影响

前言

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果

2.1大量制备pEGFP-N1，pDM138，pDM138-HPRE，pcDNA3.1(+)-GAPDH及pcDNA3.1(+)质粒

2.2 CAT ELISA结果[1]

3讨论

参考文献

第三部分GAPDH对HBs表达的影响

前言

1材料与方法

1.1材料

1.2实验方法

2结果

2.1大量提取的质粒pcDNA3.1(+)-GAPDH，pcDNA3.1(+)及pEGFP-N1

2.2构建和提取的质粒pcDNA3.1(+)-HBs和pcDNA3.1(+)-HBs-HPRE

2.3在HepG2 2.2.15细胞和瞬时表达HBs的细胞中研究GAPDH对HBs的影响[2]

3讨论

参考文献

全文总结

文献综述 HBV转录后调节元件及结合蛋白GAPDH的研究进展

致谢

攻读学位期间发表论文及参加学术会议