皮下免疫磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)对小鼠肺炎链球菌感染的保护效果和机制研究

摘要

目的：
　　肺炎链球菌磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）是糖酵解途径中发挥关键作用的酶。近年来的研究发现GAPDH不仅存在于细菌的胞内也可以定位于细菌的表面，并且参与了其它的生理过程，如细胞凋亡、DNA修复及自噬。已有研究报道GAPDH在多种细菌中与细菌毒力密切相关，并且推测其可作为一个潜在的疫苗靶点。因此，本研究拟探索皮下免疫肺炎链球菌GAPDH对小鼠抵抗肺炎链球菌感染的保护效果，并进一步探索发挥免疫保护作用的机制，为肺炎链球菌蛋白疫苗的临床前研究提供依据。
　　方法：
　　利用原核表达重组技术制备重组GAPDH（rGAPDH）蛋白，采用镍柱纯化后去除内毒素(LPS)，并通过细胞实验排除残留的LPS的干扰。实验组小鼠经皮下免疫rGAPDH及铝佐剂共四次，每次间隔两周，末次免疫后七天构建肺炎链球菌败血症模型和定植模型，通过测定生存率及鼻腔灌洗液和肺匀浆中的细菌载量来评价rGAPDH的保护效果。在体外实验部分，用rGAPDH处理骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）研究GAPDH发挥免疫保护作用相关的受体及信号通路。利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗原特异性抗体效价、抗体亚型以及细胞因子的表达。利用苏木精-伊红（HE）染色分析肺组织切片炎性改变。采用流式细胞术（FCM）分析 BMDCs表面的共刺激分子以及细胞凋亡情况。用小分子抑制剂和Western blot分析rGAPDH激活BMDCs相关的信号通路。
　　结果：
　　成功制备GAPDH重组蛋白，经SDS-PAGE分析，纯度在90%以上。用鲎试剂检测残留LPS浓度显示低于0.1EU/ml，达到体内和体外实验要求。并且在体外的 LPS排除实验中证实重组蛋白中残留的LPS不会影响后续实验。在体内实验中，我们发现用rGAPDH皮下免疫小鼠后，小鼠可以产生较高的抗原特异性抗体。在败血症模型中，实验组小鼠的生存率高于PBS对照组，有统计学差异；在定植模型中，实验组小鼠鼻腔灌洗液和肺匀浆中的细菌载量均显著低于 PBS对照组。
　　在体外试验中，我们发现rGAPDH可以引起BMDCs表面共刺激分子CD40、CD86和MHC II的高表达以及细胞因子IL-12p70、IL-6和TNF-α的释放增加，提示rGAPDH能够诱导BMDCs表型和功能的成熟。然而，用rGAPDH处理Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）缺陷鼠的BMDCs后，表面共刺激分子的表达和细胞因子水平与野生（WT）组相比显著地降低，提示rGAPDH可能通过TLR2和TLR4发挥作用。后续的研究表明 rGAPDH可以激活 MAPKs、PI3K-Akt和NF-κB的磷酸化，同时也可以上调mir-146a和下调mir-27a的表达。
　　结论：
　　1）肺炎链球菌GAPDH可以作为疫苗的候选蛋白；
　　2）rGAPDH能够通过TLR2和TLR4激活BMDCs发挥免疫保护效应。

目录

声明

中英文缩略对照

前言

1 实验材料

1.1 菌株及实验动物

1.2 实验试剂

1.3 实验仪器

2 实验方法

2.1生物信息学分析

2.2 重组蛋白GAPDH的制备

2.3 小鼠骨髓来源树突状细胞的培养

2.4 ELISA检测细胞因子及抗体效价

2.5 细胞毒性分析

2.6 细胞表面共刺激分子表达分析

2.7 Western blot分析

2.8免疫荧光试验

2.9 RNA提取及PCR分析

2.10 重组蛋白皮下免疫小鼠

2.11 定植模型和败血症模型建立

2.12 肺组织病理学分析

2.13 统计学分析

3 实验结果

3.1 序列比对结果

3.2 重组蛋白的制备

3.3皮下免疫rGAPDH对小鼠肺炎链球菌感染的保护效果研究

3.4 rGAPDH能诱导BMDCs成熟

3.5 rGAPDH 诱导BMDCs的成熟是通过TLR2和TLR4

3.6 rGAPDH诱导MAPKs、PI3K-Akt和NF-κB的磷酸化

3.7 rGAPDH调节BMDCs中microRNAs的表达

4讨论

全文总结

参考文献

文献综述:甘油醛脱氢酶在病原微生物疫苗中的研究进展

致谢

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