靶向干扰CGI-100基因对白血病K562细胞增殖与分化的影响研究

摘要

目的：本课题通过靶向干扰CGI-100基因表达后，观察人白血病K562细胞增殖、分化的改变，以及对苦参碱和氯化高铁血红素作用的反应性的改变，研究CGI-100基因在K562细胞中的功能和作用，以及K562细胞诱导分化的分子机制，阐明CGI-100基因的功能，探索肿瘤细胞诱导分化的机制，为寻找肿瘤治疗新靶点提供实验依据。 方法：设计及化学合成3对靶向CGI-100基因的短发夹结构寡核苷酸，以及一对组成相同、序列无同源性的阴性对照，分别退火成双链DNA片段，与pGenesil-1质粒连接，构建表达shRNA的重组质粒，用脂质体2000分别转染到K562细胞中进行表达，经RT-PCR法和斑点杂交法检测转染前后K562细胞中CGI-100基因表达受抑的程度，选择抑制率最高的细胞作为后续实验，命名为K562/shRNA-CGI-100。 利用MTT、联苯胺染色，流式细胞术、电镜观察等方法研究K562/shRNA-CGI-100细胞增殖、红系分化、细胞周期与细胞超微结构的变化。用0.2mg/ml苦参碱作用K562/shRNA-CGI-100细胞与对照K562细胞（包括K562/shRNA-pGenesil细胞和未转染K562细胞，下同）后，用MTT法检测细胞增殖状态变化、联苯胺染色检测各组细胞的红系分化情况、RT-PCR技术检测红系分化指标GPA与Gfi-1B mRNA表达情况、流式细胞术检测细胞表面分化抗原GPA（又称CD235a）、CD14和CD15表达水平。用30μmol/L氯化高铁血红素作用K562/shRNA-CGI-100细胞与对照K562细胞后，流式细胞术检测细胞表面分化抗原GPA表达水平。 结果：经DNA测序证实3对靶向CGI-100基因的RNA干扰表达载体pGenesil-1-CGI-100与阴性对照载体pGenesil-1-Negative构建成功。分别将上述3对干扰载体、阴性对照载体pGenesil-1-Negative与空载质粒pGenesil-1转染白血病K562细胞，经G418抗性筛选后，荧光倒置显微镜下可以观察到细胞内绿色荧光蛋白（EGFP）表达；RT-PCR与斑点杂交结果表明3对干扰载体均抑制了CGI-100 mRNA的表达，其中第1对pGenesil-1-CGI-100的抑制效率最高，达54％，将此重组细胞命名为K562/shRNA-CGI-100，作为后续实验对象。而pGenesil-1-Negative质粒与pGenesil-1质粒对CGI-100 mRNA的表达无影响。 与对照K562细胞相比，K562/shRNA-CGI-100细胞中CGI-100基因mRNA表达降低了54％；细胞常染色质减少，异染色质增加；MTT显示细胞吸光度值下降23％（P<0.05）；细胞周期相分布明显改变，G0/G1期细胞由21％增加到35％、S期细胞由56％减少到38％、增殖指数（PI）从78％降低到63％、联苯胺染色阳性率从3％升高到7％（P<0.05）。0.2mg/ml苦参碱作用48h后，MTT显示K562/shRNA-CGI-100细胞增殖抑制率从41％增高到62％（P<0.05），联苯胺染色阳性率由16％升高到23％（P<0.05），红系分化指标GPA mRNA、Gfi-1B mRNA表达明显增高（P<0.05）、流式细胞仪检测红系分化抗原GPA的MFI值增高了31％（P<0.05）；单核/巨噬细胞系分化指标CD14在各组细胞均未表达、粒系分化指标CD15虽有表达，但三种细胞之间无统计学意义（P>0.05）。30μmol/L氯化高铁血红素分别处理K562/shRNA-CGI-100与对照K562细胞后，前者细胞表面GPA的MFI升高了20％（P<0.05），MFI值为1485，是0.2mg/ml苦参碱处理组的1.7倍，差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论：成功构建了针对CGI-100基因的RNA干扰表达载体，并筛选出1对抑制效率较高的重组干扰载体。CGI-100基因的低表达能抑制K562细胞增殖、使细胞幼稚程度减弱、使K562细胞向红系分化的能力增强，并且增加了K562细胞对苦参碱和氯化高铁血红素的敏感性。氯化高铁血红素的红系诱导分化作用强于苦参碱，但CGI-100基因受抑后，K562细胞对苦参碱的敏感性大于氯化高铁血红素。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英汉缩略语名词对照

声明

前言

第一部分：靶向CGI-100基因shRNA干扰载体的构建与鉴定

1材料与方法

2结果

3讨论

第二部分：下调CGI-100基因对白血病K562细胞生物学特征的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

第三部分：K562/shRNA-CGI-100细胞红系诱导分化的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

附图

文献综述 RNA干扰技术在肿瘤治疗研究中的应用进展

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文