纳米银离子对铜绿假单胞菌生物被膜的细菌死亡率及其结构的影响

摘要

第一部分： [目的]模拟体内环境，体外建立细菌生物被膜模型，为进一步深入研究细菌生物被膜生物学特点提供基础。 [方法]将粘附载体置于气溶胶法和摇床法模拟体内细菌生物被膜形成的微环境中，将铜绿假单胞菌株培养3天后，取出标本分别进行通过FITC-ConA染色及SYTO9/PI染色，然后分别进行荧光显微镜检测及激光共聚焦检测，观察细菌生物被膜的形成情况；进行电子显微镜扫描观察形成的细菌生物被膜的形态特点。 [结果]在气溶胶的微环境下，FITC-ConA染色后在荧光显微镜观察到明亮成片状的细菌生物被膜；SYTO9/PI染色后在激光共聚焦检测，观察到片状，层叠如积云状，棉絮样的细菌生物被膜；在电子显微镜扫描观察到大量细菌成团聚集，团状丛生突出表面，具有立体结构的细菌生物被膜。在摇床法的微环境下，用三种检测方法都观察到成流线状的细菌生物被膜。 [结论]运用气溶胶法、摇床法可成功建立分别模拟体内呼吸系统及循环、泌尿系统的微环境下生物被膜形成模型。 第二部分： [目的]探讨纳米银离子对细菌生物被膜（Biofilm，BF）的细菌死亡率和其空间结构的影响。 [方法]采用摇床法，以纳米银离子含量不同的乙烯-醋酸乙烯酯（Ethylene-Vinyl acetate，EVA）塑料为细菌粘附载体，模拟体内铜绿假单胞菌（P.aeruginosa，PA）BF形成的微环境，建立体外BF模型；将培养3d的空白标本分别在扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）下及用FITC-ConA染色后荧光显微镜下观察不含纳米银EVA中BF的形成情况；将生长0.5、1、2、3、5d的BF模型行SYTO9/PI染色，激光共聚焦扫描电镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）下摄取不同层面的图像，然后应用Image Pro Plus6.0分析软件分析不同干预条件下PAO1菌株BF的细菌的死亡率和应用ISA分析软件获得PAO1菌株BF的相关空间结构参数定量化数据。 [结果]①运用SEM及荧光显微镜的方法，在以不含纳米银EVA塑料为细菌粘附载体上培养3d的标本中均观察到流线状的BF形成。②Image Pro Plus6.0分析软件定量化分析显示，纳米银离子含量、作用时间对PAO1菌株BF的细菌死亡率均有明显影响（F=84.62，85.67，p<0.0001）；不同时间组含有纳米银离子材料的PAO1菌株BF的细菌死亡率均显著高于空白对照组（P<0.05）；纳米银离子含量不同的2种材料上PAO1菌株BF的细菌死亡率无明显影响（P>0.05）；纳米银离子含量不同的（0、0.05％、0.1％）材料上PAO1菌株的BF，其第1、2、3天细菌死亡率均分别显著高于第0.5、5d的细菌死亡率（P<0.05）；含纳米银离子0.1％的材料上BF在作用的第2天其细菌死亡率最高（88.53±1.88）％。③ISA软件定量化分析显示，银离子含量、作用时间对BF空间结构均有明显影响，不同时间组含有纳米银离子材料上BF的区域孔率（Areal Porosity，AP）、平均扩散距离（Average Diffusion Distance，ADD）及结构熵（Textural Entropy，TE）影响的均显著高于空白对照组（P<0.05），但2种纳米银离子材料上BF的AP、ADD及TE的影响无统计学差异（P>0.05）。随着培养时间的延长，各含纳米银离子材料组PAO1菌株BF的AP值、ADD值无明显的变化趋势，同一时间组的含有纳米银离子材料组PAO1菌株BF的AP值都高于空白对照组的AP值；同一时间组的含有纳米银离子材料组PAO1菌株BF的ADD值都低于空白对照组的ADD值。各含纳米银离子材料组PAO1菌株BF的TE值随着时间的延长，都呈先升高后降低的趋势，2d组都为最高值；同一时间组的TE值随着含纳米银离子的增加都呈降低趋势。④随着时间的延长，各含纳米银离子材料组PAO1菌株BF的平均厚度都呈先升高后降低的趋势，3d组都达最高值；纳米银离子的含量对BF厚度的影响无统计学差异（F值=2.11，p>0.1），作用时间对BF厚度的影响有统计学差异（F值=985.81，p<0.001）。 [结论]①运用摇床法成功建立了体外PAO1菌株BF模型；②纳米银离子对PAO1菌株BF内的细菌有明显杀灭作用，对PAO1菌株BF空间结构有显著的影响。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

第一部分用气溶胶法和摇床法建立铜绿假单胞菌生物被膜体外模型

前言

1.材料和方法

2.方法和步骤

3.结果

4.讨论

第二部分纳米银离子对铜绿假单胞菌生物被膜的细菌死亡率及其结构的影响

前言

1.材料和方法

2.方法

3.结果

4.讨论

全文总结

参考文献

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文献综述:银离子对微生物作用的研究进展

致 谢

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