结缔组织上清液对骨髓间充质干细胞分化的诱导

摘要

目的：骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）具有易于获取，高度的增值、自我更新能力，可跨胚层分化为三个胚层来源的细胞等特点，因而被广泛应用于组织工程、再生医学及临床多种疾病的细胞移植治疗。体外BMSCs能诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、皮肤上皮细胞等。有研究表明体内局部微环境也可诱导BMSCs分化成与微环境功能相适应的细胞，但是其机理尚不十分清楚。课题组前期研究提示结缔组织中的生长因子可能是其诱导BMSCs向上皮细胞分化的内源性因素。本实验拟①检测羊膜、胎儿肠粘膜下层的结缔组织中EGF和IGF-1含量；②比较羊膜、胎儿肠粘膜下层的结缔组织上清液在体外诱导BMSCs分化为上皮细胞的作用差异，从而为进一步研究局部微环境诱导BMSCs分化的机制及其在组织工程中的应用，提供理论基础和实验依据。
　　第一部分不同培养基对BMSCs增殖及其向上皮分化的影响
　　1.收集4例4～5个月引产胎儿的骨髓细胞，以全骨髓直接贴壁法分离、培养、扩增BMSCs，流式细胞仪检测P3BMSCs的表型，体外诱导成骨分化。结果显示：P3-BMSCs为均一的长梭形，呈典型的漩涡状生长；细胞表面标记物CD29、CD71为阳性，CD34、HLA-DR为阴性；体外诱导后可以向成骨分化。
　　2.观察了DMEM-L、DMEM-H、DF12培养基对BMSCs的增殖和衰老的影响。结果表明：DMEM-L培养的BMSCs至P9，生长良好，衰老染色阳性细胞率略低于其它培养基组，但差异无统计学意义,P＞0.05。
　　3.在3种培养基中分别加入终浓度为30ng/mL的EGF体外诱导P3-BMSCs培养7d后，均可见少数细胞呈宽大扁平的上皮样细胞；诱导后细胞表达CK+细胞率统计显示：DMEM-L培养的BMSCs表达CK+细胞率高于其余两组，P＜0.01；空白对照组的CK均为阴性；未检测出表达CK20阳性细胞。提示DMEM-L培养基有利于BMSCs体外向上皮细胞分化。
　　第二部分结缔组织上清液对BMSCs分化的诱导
　　1.取10例羊膜和20例4～5个月引产胎儿的肠壁。机械分离和酶消化法除去上皮，制成羊膜和肠粘膜下层的结缔组织块。光镜观察结缔组织表面无上皮细胞。
　　2.另各取4例羊膜结缔组织和胎儿肠壁结缔组织，用孵育法（每12h取样）和匀浆法制备结缔组织上清液，ELISA法检测上清液中EGF、IGF-1含量。结果：①孵育48h后肠壁和羊膜结缔组织上清液中EGF含量均达到高峰，分别为320.22±0.257pg/g肠壁结缔组织和299.20±0.994pg/g羊膜结缔组织。②肠壁和羊膜结缔组织匀浆中EGF含量分别为277.56±183pg/g肠壁结缔组织和260.34±1.660pg/g羊膜结缔组织。③肠壁和羊膜结缔组织上清液中的EGF含量差异均没有统计学意义；孵育法获得的上清液中EGF含量多于匀浆法，P＜0.05。④仅1例肠壁结缔组织孵育48h后测得上清液中IGF-1为1.26pg/mL，其余时间点及检测组未测出IGF-1。提示：①本条件测得肠壁结缔组织和羊膜结缔组织中EGF含量无差别。②孵育法较匀浆法制备的上清液中可以检测出更多的EGF，48h达峰值。③本条件几乎测不出IGF-1含量。
　　3.无菌取肠壁和羊膜结缔组织，每100mg组织加入1mL培养基，孵育48h后收集上清液，离心过滤，-20°C保存备用。用前制成含10％FBS、EGF终浓度约为30pg/mL的溶液。
　　4.取P3-BMSCs以2.0×104个/mL接种于细胞爬片上。用肠壁上清液和羊膜上清液（分别设EGF终浓度为7.5、15、30pg/mL）诱导培养。并设EGF（30pg/mL、30ng/mL）对照组和空白对照组。诱导后第4d和第7d收集细胞爬片，免疫组织化学染色检测CK、CK20阳性细胞率。结果：①两种结缔组织上清液诱导组和阳性对照（EGF30ng/mL）组诱导4d后即有CK阳性细胞表达；EGF30pg/mL对照组和不加EGF的空白对照组不表达CK。②肠壁结缔组织上清液诱导7d后有CK20阳性细胞，羊膜上清液诱导组和3个对照组均没有CK20阳性细胞。③诱导后4d、7d，CK阳性细胞表达率羊膜上清液组＞肠壁上清液组＞阳性对照（EGF30ng/mL）组，P＜0.05。
　　5.将DAPI标记的P3-BMSCs种植于羊膜上，分别加入肠壁上清液和羊膜上清液（均含终浓度为30pg/mL的EGF）、以及不同浓度的EGF（30ng/mL、30pg/mL、0pg/mL）诱导培养，并设细胞爬片对照组。各组诱导7d后的铺片、细胞爬片经免疫荧光染色后，CLSM下分别计数有蓝色荧光标记核的细胞质中有CK、CK20绿色荧光的细胞，计算出其阳性细胞率。结果显示：①羊膜结缔组织单独或者联合肠壁和羊膜结缔组织上清液诱导组CK、CK20阳性细胞率均高于未联合组，P＜0.01。②肠壁上清液组表达CK20的细胞数高于羊膜上清液组,P＜0.05。③单独用外源性EGF不能诱导细胞表达CK20。
　　全文结论：
　　1.全骨髓直接贴壁法可有效分离、扩增BMSCs，并能在体外成骨分化，具有BMSCs的表型特征。DMEM-L培养基更适于BMSCs扩增和体外向上皮分化。
　　2.测得肠壁和羊膜结缔组织中EGF含量分别为320.22±0.257pg/肠壁结缔组织g，299.20±0.994pg/羊膜结缔组织g。IGF-1的含量非常低。
　　3.肠壁结缔组织上清液能诱导BMSCs爬片细胞分化为上皮细胞和具有肠上皮细胞表型的上皮细胞；而羊膜结缔组织上清液和外源性EGF只能诱导该细胞分化为上皮细胞，不能诱导其分化为具有肠上皮细胞表型的上皮细胞。
　　4.将BMSCs接种在羊膜结缔组织上，联合肠壁和羊膜的结缔组织上清液均能诱导BMSCs分化为上皮细胞，以及具有肠上皮细胞表型的上皮细胞。
　　5.单独用羊膜结缔组织，以及羊膜联合外源性EGF均能诱导BMSCs分化为上皮细胞和具有肠上皮细胞表型的上皮细胞，但作用较弱。单独用肠壁结缔组织上清液可诱导BMSCs分化为具有肠上皮细胞表型的上皮细胞，但单独用羊膜结缔组织上清液没有该作用。
　　6.肠壁和羊膜的结缔组织上清液诱导BMSCs分化为上皮细胞的作用有差异，提示这两种结缔组织可能含有不同种类和浓度的细胞因子，EGF只是结缔组织诱导BMSCs分化为上皮细胞的内源性因素之一。

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前言

第一部分 不同培养基对BMSCs增殖及其向上皮分化的影响

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

第二部分 结缔组织上清液对BMSCs分化的诱导

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

全文结论

参考文献

附插图

文献综述: 间充质干细胞移植与胃肠上皮细胞再生

致谢

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