抑制coronin-1基因表达的siRNA质粒载体的构建及筛选研究

摘要

目的：构建特异性抑制Coronin-1基因表达的siRNA表达载体,并筛选出具有最高抑制效率的质粒载体。
　　 方法：提取鼠巨噬细胞总RNA,RT-PCR扩增Coronin-1基因目标序列,将其连接到pSEB-HUS真核表达质粒上,重组质粒经酶切和DNA测序鉴定后命名为pSEB-HUS-C。将设计、合成的3条siRNA及阴性对照分别克隆入pSEB-HUS-C,构建重组pSEB-HUS-C1、pSEB-HUS-C2、pSEB-HUS-C3及pSEB-HUS-CN质粒。将干涉质粒瞬时转染A549细胞,通过绿色荧光信号观察不同重组质粒对Coronin-1表达的影响。最后用实时定量PCR和Western blot法检测其对Coronin-1基因表达的抑制效率。
　　 结果：经双酶切及测序证实,所构建siRNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。经瞬时转染A549细胞后,其中的pSEB-HUS-C3能明显抑制Coronin-1 mRNA的表达和Coronin-1蛋白的合成,抑制率分别是75.9％和75.1％。
　　 结论：成功构建并筛选出高效、特异性抑制Coronin-1表达的siRNA表达载体,为进一步研究Coronin-1在巨噬细胞中的作用奠定了基础。