人表皮光老化相关蛋白的比较蛋白质组学研究

摘要

目的:本研究选择人表皮组织为研究对象。1.建立适合人表皮组织的双向电泳技术、获得质量优良的人表皮蛋白质组双向电泳图谱。2.筛选并分析中年人表皮中与皮肤光老化相关的蛋白质。
　　 方法:1.取人皮肤标本20例(部位:包皮),将表皮用DispaseⅡ与真皮分离,提取人表皮组织总蛋白,以17cm固相pH梯度胶条(pH3～10)进行双向电泳,将硝酸银染色后的双向电泳凝胶予以扫描,使用PDQuest8.0图像分析软件对其进行强度校正、点检测、定量、凝胶匹配、背景扣除、ID校正等,并对实验的重复性进行分析,对样品制备、上样量、等电聚焦参数及硝酸银染色等关键步骤进行改进优化。2.将取自中年人的皮肤标本40例(年龄45～59岁),分为曝光组(20例；部位:面部、头皮)及非曝光组(20例；部位:臀部、会阴部),使用方法1中建立的技术平台分离两组的表皮总蛋白,PDQuest8.0图像分析软件分析、对比两组2-DE图谱,检测出组间差异表达的蛋白点,并通过MALDI-TOF-MS及数据库检索来鉴定差异候选蛋白。
　　 结果:1.获得了分辨率高、重复性好且清晰的人表皮双向电泳图谱,分离出500余个蛋白点；本实验重复3次,所得图谱非常相似,胶问匹配率为85.5％。分离出蛋白点551±31个,主要分布在分子量14～100KD、pH5～8之间；所得蛋白点数量适中、分辨率高,无条纹及背景干扰。2.曝光组2-DE凝胶图谱上获得蛋白点587±14个,非曝光组534±15个。共检测出组间差异表达的蛋白点32个-(1)非曝光组,特异表达:3个；高表达:9个。(2)曝光组,特异表达:6个；高表达:14个。随机选取3个在曝光组差异表达的蛋白质点进行鉴定,鉴定结果为:B2:P21活化激酶6(p21-activated kinase6,PAK6),B4:谷胱甘肽转移酶P1-1(Glutathione transferase P1-1,GSTP1-1),B6:热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)。
　　 结论:通过对关键技术进行改进,获得了高分辨率和高重复性的人表皮2-DE凝胶图谱。建立了适合人表皮蛋白质组学研究的技术平台,为寻找皮肤光老化标志物奠定基础。日光慢性积累性辐射自然生长的人表皮,能够引起其蛋白质组发生相应改变。已鉴定的3个差异蛋白极有可能在人皮肤光老化的发生发展过程中发挥着极其重要的作用,甚至可能成为皮肤光老化的临床诊断标志物。