肺炎链球菌体内诱导基因spd1672影响细菌荚膜形成的机制研究

摘要

荚膜多糖是肺炎链球菌的主要毒力因子，它具有抗吞噬作用，可使其免受宿主免疫攻击。荚膜丢失的肺炎链球菌很容易被吞噬细胞清除，毒力下降。本课题组前期工作从肺炎链球菌中筛选到一些体内诱导基因，其中的基因spd1672经过生物信息学分析，其表达产物含有脂质A核心-O抗原连接酶结构域，提示该基因可能与细菌荚膜形成相关。本课题拟对该基因与荚膜形成相关的功能进行初步鉴定。
　　 方法：采用长臂同源多聚酶链式反应（Long flanking homologypolymerase cham reaction，LFH-PCR）构建spd1672缺陷菌；用小鼠毒力体内实验比较spd1672缺陷菌与野生菌的毒力：通过菌体连接实验，将无荚膜的R6菌（含有SPD1672蛋白）和spd1672等位基因缺陷的R6菌株分别与D39△spd1672缺陷菌的荚膜多糖（CPS）共同孵育，ELISA检测菌体表面的CPS量，分析SPD1672蛋白的连接酶功能；利用透射电镜技术、ELISA和Immunblotting技术分析spd1672缺陷后细菌表面荚膜多糖的改变；并通过FQ-PCR技术检测cps基因簇cps2A、cps2D、cps2E、cps2H、cps2K、和RfbC的mRNA表达量，分析spd1672基因对荚膜多糖合成基因的调控作用。
　　 结果：成功构建D39Aspd1672缺陷菌株；小鼠体内毒力实验显示注射D39△spd1672缺陷菌的小鼠全部存活，毒力较野生菌株显著减低（*P<0.05），且注射到小鼠腹腔的缺陷菌全部被清除，腹腔液涂片未见细菌。透射电镜观察发现D39△spdl672基因缺陷菌株荚膜结构不复存在。菌体连接实验结果显示，无荚膜的R6菌（含有SPD1672蛋白）与D39Aspd1672缺陷菌CPS共同孵育2小时后，R6菌体表面的CPS量增加，接近于野生菌的水平，spd1672等位基因缺陷R6菌株的CPS量未见增加；Immunoblotting分析结果显示，D39△spd1672缺陷菌的细胞壁检测不到CPS，原生质的CPS量较野生菌显著减少，且缺乏大分子量的荚膜多糖成分；由于D39△spd1672缺陷菌不能利用环境中的荚膜多糖，ELISA分析D39△spdl672缺陷菌体中CPS量较野生菌显著减少，但培养基上清的CPS量较野生菌多。荧光定量PCR测定结果显示，除了cps2A无变化，D39△spd1672缺陷菌株的cps2D、cps2E、cps2H、cps2K、RfbC基因表达都较野生菌的显著下降（*P<0.05）。
　　 结论：上述实验结果提示：spd1672基因表达产物能将荚膜多糖连接到细菌表面，是一种新的肺炎链球菌荚膜多糖连接酶，是否有聚合酶功能，尚需更多的实验证据；spd1672基因还影响了多个荚膜多糖合成基因的表达，在荚膜形成调控机制中起关键作用；小鼠体内毒力实验提示spd1672基因是肺炎链球菌中的一个新的毒力因子。