静脉移植骨髓间充质干细胞在溃疡性结肠炎大鼠结肠的分布

摘要

目的：骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能[1],在机体组织损伤修复过程及细胞移植治疗等多个领域有广阔的应用前景。随着BMSCs用于组织修复和基因治疗的研究,体内以及体外培养扩增的BMSC的定向募集迁移潜能引起人们的关注。本实验将分离、培养、扩增、荧光标记大鼠BMSCs,经静脉移植入溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型大鼠,拟探讨移植细胞浓度、以及硝普钠对BMSCs归巢到结肠的影响。为BMSCs在消化管组织工程以及肠黏膜损伤性疾病治疗研究中的应用,提供基础理论和实验依据。
　　 第一部分骨髓间充质干细胞的生物学特性
　　 1.取4-6w SD大鼠骨髓细胞,分离、培养、扩增获取BMSCs。流式细胞仪检测第3和第5代(P3和P5)BMSCs的免疫表型。结果:分离、培养原代细胞3～12d,细胞数量迅速增多,具有典型的长梭状的形态及漩涡状排列的特征。流式细胞仪分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。表达CD44、CD90的均一性分别为98.26±0.48％及98.68±0.32％。
　　 2.取P3大鼠BMSCs用1μmoL/L的地塞米松、0.5 mmoL/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10 mg/L的胰岛素、100mmoL/L的吲哚美辛(indomethncin)和10％FBS的H-DMEM诱导培养。诱导第3d起光镜下可见细胞变为圆形或椭圆形,胞质有脂滴。诱导第10d,油红O染色脂滴呈橘红色;对照组仍为长梭形,无脂滴出现。另用含地塞米松0.1μmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C 50mg/L和10％FBS的L-DMEM的条件培养液定向诱导P3细胞向成骨细胞分化。从诱导第2d开始,部分细胞由长梭形逐渐变为立方形,进而转变为多角形,培养第8d时,大多数细胞转变为多角形,19d左右出现钙化结节,茜素红染色呈橘红色;对照组细胞仍为长梭形,未见钙结节形成。
　　 第二部分静脉移植骨髓间充质干细胞在溃疡性结肠炎大鼠结肠的分布
　　 1. SD大鼠30只随机分为A、B、C组,以免疫+TNBS/乙醇复合法建立UC模型。制备DAPI荧光标记的P3～P5-BMSCs悬液备用。模型制备完成后24 h内,3组大鼠均经尾静脉注射1mL分别含1×106、5×106、1×107的DAPI标记的BMSCs。移植后第7、14 d各处死5只大鼠,取结肠做恒冷切片,荧光显微镜下计数各组DAPI标记BMSCs在溃疡部位和正常部位的细胞数。相同切片再经HE染色,观察形态。结果:移植后第7、14 d,各组大鼠结肠均见蓝色荧光标记的BMSCs,主要分布于黏膜层及黏膜下层,偶见于肌层及外膜。统计结果显示:移植第7、14 d各组溃疡部位阳性细胞数明显高于正常部位阳性细胞数(F=65.17,P0.01);移植第7d,B组溃疡及正常部位的细胞数均高于A组(F=13.06,P 0.05),B组与C组差异不显著。
　　 2. SD大鼠20只随机分为D、E组,同样方法建立UC模型。制备DAPI荧光标记的P3～P5 BMSCs悬液备用。模型制备完成后24 h内,2组大鼠均经尾静脉注射1mL含5×106荧光标记的BMSCs悬液,E组同时加入含0.2mg/kg体重的硝普钠。移植后第7、14 d每组各处死5只大鼠,取结肠观察计数各组DAPI标记BMSCs在结肠溃疡部位和正常部位的细胞数。相同切片再经HE染色,观察形态。结果:移植后第7、14 d,荧光标记的BMSCs在D、E组UC大鼠结肠的主要分布同A、B、C组。移植第7、14 d各组溃疡部位阳性细胞数明显高于正常部位阳性细胞数(F=354.54,P 0.01);移植第7 d,E组溃疡处的细胞数均高于D组(F=15.00,P 0.05);第7d和14d,E组正常部位的细胞数均高于D组(F=23.12,P 0.05)。
　　 全文结论：
　　 1.用贴壁筛选法,成功分离得到大鼠BMSCs,流式细胞仪分析培养的P3、P5-BMSCs具有MSCs的表面标记特征。
　　 2.所获P3-BMSCs在体外可诱导分化为成骨细胞或者脂肪细胞,证明所分离的BMSCs具有多向分化的能力。
　　 3.移植第7、14 d,各组结肠溃疡部位荧光标记的BMSCs细胞数明显高于非病变部位,这提示病损的组织和器官对BMSCs可能有特异的趋化作用。
　　 4. 3种剂量BMSCs经静脉移植入UC大鼠后在其结肠分布的统计结果显示,并非移植细胞数量越多,迁移到结肠损伤部位的细胞就越多,最适移植细胞数量为5×106个。
　　 5.单纯移植BMSCs与联合硝普钠移植BMSCs比较,前者迁移到结肠的BMSCs数明显低于后者。表明移植细胞同时给与硝普钠能促进BMSCs向结肠的迁移。