人舌癌细胞株Tca8113中ABCG2蛋白表达的意义及其SP细胞群的分选

摘要

目前肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，肿瘤干细胞（tumor stemcells）学说认为肿瘤是一种干细胞疾病，是由具有成瘤能力的肿瘤细胞增殖发育而形成的异常组织。肿瘤细胞中仅有极少数的细胞具有成瘤潜能。现在肿瘤干细胞的研究已经成为当代研究的热点。1996年Goodell[1]等首次提出在Hoechst33342染色的骨髓细胞中存在着一群染色很浅的细胞群，并将其命名为side population（SP细胞），在SP细胞里富含了大量的干细胞成分，不仅表型上大部分和干细胞表型一致，而且在功能验证中体现了很强的造血组织重建能力。ABCG2作为一种转运蛋白，在维持细胞自身稳定及机体正常生理功能等方面发挥着重要作用。随着干细胞研究的不断发展，发现它直接参与了干细胞特性--SP表型的形成。SP细胞较高表达ABCG2蛋白，可将荧光染料Hoechest33342泵出细胞外，与main population（MP）细胞比，SP细胞表现为较弱的Hoechst33342激发荧光特性。
　　 本研究以人舌癌细胞株Tca8113为研究对象，通过流式细胞技术（FACS）分选人舌癌细胞株Tca8113中的侧群细胞（SP细胞）、非侧群细胞（MP细胞），检查ABCG2蛋白在SP细胞、非SP细胞、T（Tca8113）细胞中的表达情况，并探讨其意义。为今后进一步分选纯化类肿瘤干细胞及分离肿瘤干细胞提供有效手段。
　　 研究方法及结果：
　　 1.人舌癌中ABCG2蛋白表达的意义
　　 方法：人舌癌细胞株Tca8113，用含15％小牛血清的1640培养液培养，放于37℃，含5％CO2的培养箱中，等细胞贴壁生长达70％-80％时，用0.125％的胰蛋白酶消化传代，在盖玻片上爬片，置于6孔板中培养，观察细胞生长状态良好，把细胞爬片固定于载玻片上，用10％甲醛固定60～90 min。然后加入鼠抗人ABCG2-抗和FITC羊抗鼠二抗，双通道激光共聚焦显微镜下行细胞免疫荧光观察。另外收集生长状态良好的Tca8113细胞，200μL PBS重悬细胞，加入鼠抗人ABCG2-抗和FITC羊抗鼠二抗，上流式细胞仪分析，检测ABCG2蛋白的表达情况。
　　 结果：绿色荧光为FITC染色的细胞，其中少量的绿色光点为FITC染色的ABCG2蛋白。流式检测结果显示ABCG2在人舌癌的表达率为5％左右。实验结果表明：人舌癌细胞株Tca8113也象某些癌细胞一样含有SP细胞。
　　 2.人舌癌细胞株Tca8113中SP细胞群的分离
　　 方法：取25瓶已培养的人舌癌细胞株Tca8113细胞，细胞总量约为108，用0.01％PBS冲洗，适量的0.125％胰酶消化，中止消化后，HBSS洗涤，重悬细胞，加入Hoechest33342。对照组同时加入维拉帕米。碘化丙啶（PI）标记死细胞。流式细胞仪检测分选，发光偏弱的即为SP细胞。去除PI阳性死细胞，收集分选出来的SP细胞、非SP细胞（MP细胞）。
　　 结果：Hoechest33342染色后，分选出人舌癌细胞株Tca8113中SP细胞的含量约为0.8％。
　　 3.人舌癌细胞株Tca8113细胞、MP细胞、SP细胞中ABCG2蛋白含量的检测及分析
　　 方法：分别收集（1～3）×105数量级的SP细胞、MP细胞和T细胞，分别用200μL PBS重悬细胞，加入鼠抗人ABCG2-抗和FITC羊抗鼠二抗，上流式细胞仪分析，检测ABCG2蛋白的表达情况。流式检测结果显示SP细胞中ABCG2的表达率为13.16％左右：未分选Tca8113细胞中ABCG2的表达率为3.29％左右：而MP细胞几乎没有ABCG2的表达。实验结果表明：人舌癌细胞株Tca8113中SP细胞较高表达ABCG2蛋白。
　　 研究结果表明：人舌癌细胞株Tca8113中存在SP细胞，并且分离出了这一小群细胞。通过分选癌侧群细胞中的ABCG2+细胞，将有可能进一步分选纯化类肿瘤干细胞，为今后分离肿瘤干细胞提供了实验基础，同时也为以后靶向肿瘤干细胞的治疗提供了新方法和思路。