杂交瘤细胞株及其产生单克隆抗体和它们在检测G2-EPSPS蛋白中的应用

摘要

本发明提供了一对杂交瘤细胞株。该对杂交瘤细胞株包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC？NO.10495；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC？NO.10494。本发明还提供了由这两株杂交瘤细胞分泌的一对配对单克隆抗体和它们在检测G2-EPSPS蛋白中的用途以及一种免疫胶体金试纸。通过上述技术方案，本发明能够通过免疫胶体金试纸，对G2-EPSPS蛋白的检测取得1ng/mL的灵敏度，对CP4-EPSPS蛋白不呈现交叉反应，并且对27种非转基因作物和14种不同来源的各种非G2-EPSPS转基因作物也不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种杂交瘤细胞对、一 种单克隆抗体对和它们在检测G2-EPSPS蛋白中的用途以及一种免疫胶体金 试纸。

背景技术

草甘膦是美国孟山都公司研发并于1974年注册的一个新型除草剂，注 册的商品名为草甘膦的理化性质稳定，合成成本低，高效、广 谱、低毒、低残留，是一型十分优秀的除草剂，也是世界上使用最广泛的 除草剂品种之一。研究发现，草甘膦通过竞争性结合EPSPS(5’-烯醇式丙酮 芒草酰-3-磷酸合酶)从而阻断莽草酸代谢途径，造成植物无法合成芳香族氨 基酸及其衍生物，以及莽草酸积累，导致植物死亡。由于自然界中绝大部 分植物体内EPSP合酶均属于草甘膦敏感型，因此草甘膦除草剂具有十分优 秀的广谱性。但是自然界微生物群体的多样性造就微生物中EPSP合酶的多 样性，部分微生物体内EPSP合酶对草甘膦不敏感，利用基因工程技术将草 甘膦不敏感EPSP合酶转入目标植物中以替代内源敏感型EPSP合酶，将使 该植物获得草甘膦除草剂抗性。美国孟山都公司利用这一策略于1989年从 根癌农杆菌CP4中克隆到了高抗草甘膦的EPSP合酶，并将该基因转入大豆 品种中，于1991年获得抗草甘膦转基因大豆品种RoundupReady，并1996 年正式进入商品化生产。

抗草甘膦除草剂转基因大豆是世界上第一例商业化种植的转基因作 物，随后孟山都公司利用该基因先后研发了多种转基因抗草甘膦作物(大 豆、棉花、玉米、苜蓿、甘蔗等)。自1996年上市以来，在全世界转基因 作物品种及种植面积迅猛增加，从171万公顷增加到2014年的1.815亿公 顷。全球种植转CP4-EPSPS作物累计超过1亿公顷。

G2-EPSPS蛋白编码基因克隆自草甘膦污染土壤细菌基因组文库，具有 很高的草甘膦耐受性。该基因编码的蛋白经分析属于ClassI类型，酶活测 定显示该蛋白具有高底物亲和能力和低草甘膦亲和力，因此能赋予宿主高 草甘膦除草剂耐受力。在酶学水平上G2-EPSPS基因草甘膦耐受性高于孟山 都公司的CP4-EPSPS基因。

在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价 时，往往需要对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。现有的检测装 置，如采用酶免、放免等方法的装置，受仪器(酶标仪、放免闪烁仪、离心 机等)、场地等因素的限制，而且检测时间长(酶免检测时间需2h、放免 检测需3h左右)，检测成本较高，很难推广应用。因此，实践中需要有一 种可快速检测转基因植物中G2-EPSPS蛋白，且操作简便、结果准确可靠、 快速的装置。

免疫结合胶体金层析法是免疫金标记技术和抗原抗体反应相结合而形 成的一种应用形式，相比ELISA，除标记物不同外，同样服从于抗原抗体 反应的特性。免疫结合胶体金层析法以微孔膜为固相载体，包括双抗体夹 心法、双抗原夹心法、捕获法和竟争抑制法等实施方法，其中，以双抗体 夹心法应用最为广泛。

双抗体夹心法主要用于检测有多个抗原位点的生物分子。双抗体夹心 法的技术方案包括：首先将已知的特异性抗体(单抗或多抗)以一定的量包 被于膜上作为检测带，可与金标物结合的二抗作为质控带。与包被抗体相 配对的另一单抗金标结合物则吸附于金标垫上并进行干燥。干燥的金标垫 一端与膜相接，一端与样品垫相连。膜的另一侧粘贴吸水垫。检测时，于 样品垫加入一定量的液体样本，借助毛细管作用，样本沿样品垫到吸水垫 的方向移动。它首先经过干燥金标垫，使金标结合物复溶，如标本中有待 测抗原，则发生抗原抗体反应，形成复合物A(金颗粒－抗体－抗原)；样 本继续移动到达检测带位置，则与包被抗体再次发生抗原抗体反应，形成 复合物B(金颗粒－抗体－抗原－包被抗体)，并于检测带的部位聚集，最 终达到肉眼可见的程度，如样本中无待检抗原，则不能形成肉眼可见的红 色条带。游离的金标结合物或复合物A越过检测带到达质控带，与二抗发 生反应，形成复合物C(金颗粒－抗体－二抗)，聚集并产生肉眼可见的红 色条带。无论样本中是否含有待检物质，质控带都会呈现红色条带。

免疫结合胶体金层析法具有操作简单、快速、可单份检验、不需要特 殊设备的优点。但目前免疫结合胶体金层析法普遍存在敏感度低，质量控制 能力不够，批间、批内和不同试剂间变异系数过大等缺陷。因此，提高抗 单克隆抗体对的敏感度和特异性，是弥补免疫结合胶体金层析法缺陷的重 要手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏特异的免疫结合胶体金层析法检测 G2-EPSPS蛋白的方法。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞对，其中， 该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株； 所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.10495；所述第二杂交瘤 细胞株的保藏编号为CGMCCNO.10494。

再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括 独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第 一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所 述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.10495；所述第二杂交瘤细 胞株的保藏编号为CGMCCNO.10494。

再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体对在检测G2-EPSPS 蛋白中的用途。

再一方面，本发明还提供了一种免疫胶体金试纸，该免疫胶体金试纸 包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C 线和T线，所述C线上包被有抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一单 克隆抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体，所述第一单 克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成单克隆抗体对，其中，所述单克隆抗 体对为如上所述的单克隆抗体对。

通过上述技术方案，本发明能够通过免疫胶体金试纸，对G2-EPSPS蛋 白的检测取得1ng/mL的灵敏度，对CP4-EPSPS蛋白不呈现交叉反应，并 且对27种非转基因作物和14种不同来源的各种非G2-EPSPS转基因作物也 不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说 明。

生物材料保藏

本发明的第一杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的， 其保藏编号为CGMCCNO.10495，保藏日期为2015年04月10日，保藏 单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市 朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗G2单 克隆抗体杂交瘤细胞株。

本发明的第二杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的， 其保藏编号为CGMCCNO.10494，保藏日期为2015年04月10日，保藏单 位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗G2单克 隆抗体杂交瘤细胞株。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分， 与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限 制。在附图中：

图1是实施例2中利用胶体金产生的信号颜色深浅，进行定性或半定量 检测的结果图。

图2是实施例2中利用胶体金产生的信号颜色深浅，对27种非转基因 作物和14种不同来源的各种转基因作物(表10)做了特异性检测实验的结 果图。

图3是免疫胶体金试纸的组装结构示意图。

附图标记说明

1样品垫2被衬底板3胶体金垫

4T线5C线6纤维素膜

7吸收垫

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的 是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制 本发明。

一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞对，其中，该杂交瘤细胞对包括 独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞 株的保藏编号为CGMCCNO.10495；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为 CGMCCNO.10494。

再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括 独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第 一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所 述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.10495；所述第二杂交瘤细 胞株的保藏编号为CGMCCNO.10494。

再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体和如上所述的单克 隆抗体对在检测G2-EPSPS蛋白中的用途。

再一方面，本发明还提供了一种免疫胶体金试纸，该免疫胶体金试纸 包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C 线和T线，所述C线上包被有抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一单 克隆抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体，所述第一单 克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成单克隆抗体对。其中，所述单克隆抗体 对为如上所述的单克隆抗体对。

其中，所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克 隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为 CGMCCNO.10495；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO. 10494。

以下，通过实施例进一步详细说明本发明。以下实施例中，所用的试 剂均为商购获得。

实施例1

对取自草甘膦污染土壤样品提取细菌总DNA，经电泳检测后来自2号 样品(G2)的总DNA质量较好。对G2细菌总DNA进行部分酶切(Sau3AI)， 回收3-20kb大小片段，同时对pACYC184质粒进行BamHI酶切，然后进行 连接反应。将连接产物转化aroA基因缺失大肠杆菌ER2799，在M9培养基 上筛选生长菌落。从生长菌落中提取质粒后进行测序鉴定，将含有EPSPS 编码基因aroA的质粒命名为pAC_G2aroA。根据NCBIblast分析结果，找到一 个长1332bp编码444个氨基酸的aroA基因，根据G2-aroA(即G2-EPSPS) 序列设计引物，在上游引物5’端人工添加BamHI酶切序列，在下游引物5’ 端人工添加HindIII酶切序列。引物合成、测序均由上海生工生物工程技术 服务有限公司完成。具体所用引物序列如表1所示。

表1

按照表2和表3所列的条件进行PCR反应。

表2

成分 体积 模板：pAC_G2aroA质粒 1μL(30-50ng) 引物1：G2aroA(FB) 1μL(50pM) 引物2：G2aroA(RH) 1μL(50pM) dNTPs 2μL(2.0mM) 10×Buffer 2μL E×Taq 0.2μL(2.5U) ddH₂O 12.8μL 共计 20μL

表3

94℃预变性DNA 5min 94℃变性 30sec 59℃退火 30sec 72℃延伸 30sec 30个循环后 72℃补充延伸 10min

按照表4所列的条件进行PCR产物与pGEM-T载体连接，并将连接产 物转化大肠杆菌。

表4

成分 体积 10×连接酶缓冲液 1μL pGEM-T载体 1μL(50ng) PCR产物 2μL(≈25ng) T4 DNA连接酶(3U/μL) 1μL ddH₂O 5μL 共计 10μL

其中，连接和转化的条件包括：4℃过夜连接，连接产物转化入大肠杆 菌(E.coli)JM109的感受态细胞中，涂布在加有Amp(50mg/mL)，IPTG (200mg/mL)和X-gal(20mg/mL)的LB平板上进行重组转化的白色菌落 筛选。质粒提取及酶切鉴定后送于诺赛生物公司测序鉴定。

按照表5和表6所列的条件，将测序检测正确插入目的片段基因序列的 重组质粒利用BamHI和HindIII限制性内切酶消化，连接到相应内切酶消化 的表达载体pET28a上，构建成重组表达载体。

表5

成分 体积 ddH₂O 15μL 重组质粒 2μL(约100ng) BamHI 0.5μL(2,000U) HindIII 0.5μL(2,000U) 10×缓冲液 2μL 共计 20μL

表6

成分 体积 ddH₂O 15μL 载体pET28a 2μL(约100ng) BamHI 0.5μL(2,000U) HindIII 0.5μL(2,000U) 10×缓冲液 2μL 共计 20μL

经过限制性内切酶消化的重组质粒和载体片段利用QXIIDNA纯化回 收试剂盒(QIAEXIIDNAGelExtractionKit)经过凝胶电泳进行目的片段回 收，回收方法包括：(1)将目的条带从0.5％的琼脂糖凝胶上切下，称量其 重量；(2)加入3倍体积的QXIBuffer和2倍体积的灭菌的超纯水和5μl 的QXII悬浮液；(3)50℃水浴10min，直至胶全部溶解；(4)以最大速度 离心0.5min，弃上清；(5)沉淀重悬于500μL的QXIBuffer，以最大速度 离心0.5min，弃上清；(6)沉淀重悬于500μL的PEBuffer，以最大速度离 心0.5min，弃上清；(7)沉淀干燥后加入30μL的ddH₂O；(8)50℃水浴 10min；(9)以最大速度离心0.5min，上清转管(即为所得纯化的总DNA 液体)；(10)电泳检测，贮存于-20℃。

利用T4DNA连接酶将回收后的BamHI和HindIII消化后的目的片段和 载体pET28a片段连接，连接混合液中加入载体和外源片段的摩尔比约为 1:3。连接体系如表7所示。

表7

成分 体积 10×Ligase buffer 1μL pET28a Vector 1μL(50ng) 目的片段 1.5μL(≈25ng) T4 DNA Ligase(3U/μL) 1μL ddH₂O 5.5μL Total 10μL

混匀，4℃过夜连接，连接产物转化入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3) 的感受态细胞中，在含有50μg/mL的Km抗生素的平板上进行筛选并进行 质粒的酶切鉴定。

将BL28_G2AroA接入到50mL含50mg/L卡那霉素(Km)LB液体培养基 中，37℃摇菌培养至OD₆₀₀值为0.5～0.7时，加入IPTG(200mg/mL)诱导 蛋白的表达，菌液转入30℃培养，0～8h每隔1h取样1.5mL菌液， SDS-PAGE电泳检测。将IPTG诱导合适时间的菌液离心并收集菌体，加入 2mLE-Buffer(5mMTris-HClpH7.8，1mMEDTApH8.0，1mMDTT)重 悬菌体，于-86℃冻融一次，然后超声波破碎(200W，超声1.5Sec，间隔 2.5Sec，10-20min)，4℃，12,000rpm离心去除细胞碎片，上清液为粗提物， 取少量上清液进行SDS-PAGE电泳检测，其余上清液加入50％(w/v)甘油， 混匀后于-20℃保存备用。

从上清液中提纯G2-aroA蛋白(即G2-EPSPS蛋白)。融合蛋白的N端 含有6个His-Tag，因此采用Ni-NTA偶联的NTA树脂进行亲和层析纯 化。首先将G2-aroA融合蛋白上清液逐步滴加到层析柱中，利用重力作用过 滤溶液。而后层析柱用含不同咪唑梯度(10，50，100，150，200，250mM) 的NTA洗脱液洗脱蛋白，分部收集洗脱液。当洗脱液中的咪唑浓度在200 mM时，蛋白洗脱量最大。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测收集到的蛋白纯度后用 透析液(20mMHepe、pH7.5、1mMDTT、200mMKCl和50％甘油)对 纯化蛋白进行透析，将纯化的蛋白分装，-70℃保存。

实施例2

G2-EPSPS蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

1.实验方法

1.1小鼠的免疫

(1)选用8W⁺的BALB/c雌小鼠按剂量分组免疫4次：(初次免疫前 取眼血作为阴性对照)，免疫剂量分别为50、100、150、200μg/只(即实 施例1得到的G2-EPSPS蛋白)。初次免疫时加等体积福氏完全佐剂皮下多 点注射；以后隔两周进行一次免疫，以相同剂量重组抗原加等体积福氏不 完全佐剂皮下多点注射，追加免疫两次。第三次免疫结束后10天左右用重 组抗原包被ELISA板，用间接ELISA测定小鼠血清的抗体效价；

(2)融合前三天对抗体效价最高的(1:10⁵以上)小鼠尾静脉注射加强 免疫(50μg)。追加免疫72h后进行细胞融合。

1.2细胞融合

1.2.1饲养细胞制备

细胞融合前一天，按照以下方法制备饲养层细胞：

(1)将8W⁺健康雄性BALB/c小鼠，拉颈处死后，于75％乙醇浸泡2-3 min；

(2)移至超净台内，以仰卧位固定在解剖板上，用眼科剪剪开胸腹部 皮肤，用镊子纵向两侧剥离，暴露腹壁，并用75％乙醇消毒其腹膜；

(3)用止血钳轻轻拉起腹膜，将10mL预温的1640培养基用注射器注 入腹腔，用棉球轻揉腹腔1-2min，吸出细胞悬液，放入离心管中；

(4)离心：1000rpm，5min，弃上清；

(5)用10mL含血清HAT培养基将细胞混匀，细胞计数，调整细胞密 度于2×10⁵/mL；

(6)将此细胞悬液加入96孔细胞培养板，100μL/孔，则细胞数为 2×10⁴/孔；

(7)置37℃，5％CO₂孵箱培养，供次日融合实验用。

1.2.2骨髓瘤细胞SP2/0的制备

(1)收获对数生长期SP2/0细胞，用1640培养基洗涤3次，离心1000 rpm，5min，弃上清；

(2)用1640培养基重悬细胞。取100μL细胞悬液，以0.2％台盼蓝染 色，进行细胞计数，要求细胞活力>95％，并调整细胞密度待用。

1.2.3脾细胞悬液的制备

(1)将3天前经过冲击免疫的BABL/c小鼠摘除眼球放血，断颈处死， 于75％乙醇浸泡2min；

(2)移至超净台内，剪开腹部皮肤向两侧剥离，暴露腹壁；换剪刀、 镊子，剪开腹膜，取出脾脏，去掉脂肪和结缔组织，用1640培养基冲洗；

(3)将脾脏置于200目的筛网上，一边用注射器芯轻轻地研磨；一边 以培养液冲洗，收集脾细胞悬液，离心1000rpm，5min，弃上清；

(4)用1640培养基重悬细胞，离心洗涤2次：1000rpm，5min，弃上 清；

(5)用10mL不完全培养基重悬。取100μL细胞悬液，以0.2％台盼 蓝染色，要求细胞活力>95％，并计数脾细胞。剩余细胞调整细胞密度待用。

1.2.4细胞融合及培养

(1)将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1比例放于50mL离心管中混 匀，1000rpm离心5min，弃上清，用食指轻弹离心管底部，使细胞沉淀 松散呈糊状；

(2)一边均匀转动离心管，一边用1mL吸管逐滴加入50℃预温的50％ PEG40001mL，于1min内完成；

(3)加1mL,37℃预热的1640培养基，在1min内完成；

(4)加10mL，37℃预热的1640培养基，在5min内完成；

(5)离心：800rpm，8min；细胞沉淀重悬于100mLHAT培养基中；

(6)按100μL/孔将细胞悬液转移到接种了饲养细胞的细胞培养板中， 同时留2孔加未经融合的SP2/0细胞作对照，观察细胞对HAT的敏感性。 培养板置于37℃、5％CO₂孵箱中培养；

(7)融合7天后，采用半量换液的方式更换HAT培养液。以后每3-5天 半量换液一次；

(8)3-4周后，换完全培养基维持培养。

1.3ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

(1)融合后的细胞培养约12-15天左右，生长到培养孔底面积的1/4 时，取上清用间接ELISA法检测特异性反应和交叉反应，对杂交瘤细胞进 行筛选。重组蛋白G2-EPSPS为包被抗原，包被浓度5μg/mL常规包被 ELISA板。往包被ELISA板中加100μL/孔的细胞培养上清液，以免疫鼠血 清为阳性对照(1:50稀释，稀释液为PBS)，SP2/0细胞孔培养上清为阴性 对照。细胞上清与包被ELISA板孵育1h，充分洗涤后加入HRP标记的羊 抗鼠IgG抗体(1:10000稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，弃二抗。充分洗 板后每孔加TMB100μL显色15min，再加入1NH₂SO₄50μL/孔终止反应。 测定OD₄₅₀值。

(3)ELISA筛选获得132株分泌G2-EPSPS单抗的细胞株；上述132 株G2-EPSPS单抗的细胞株所分泌的单克隆抗体均对重组G2-EPSPS蛋白具 有阳性反应。选择其中阳性反应最强的20株细胞进一步亚克隆培养，其余 细胞株直接扩大培养，冻存和少量生产腹水。

1.4有限稀释法进行克隆化培养

(1)克隆化的前一天按照上述方式制备饲养层细胞；用HT培养液按 100μL/孔接种于96孔培养板中；

(2)用移液器将待克隆的细胞吹打混匀，用含20％血清的HT选择 培养液稀释至1个细胞/孔的密度；

(3)按照1个细胞/孔加到已有饲养细胞的细胞板，置5％CO₂、37℃ 的培养箱中进行培养；

(4)培养至第4天时，在倒置显微镜下观察并记录细胞单克隆生长孔； 培养1周左右，当细胞培养液变黄时，做好标记，吸取100μL上清，用上 述ELISA法检测细胞培养上清；

(5)隔3天左右待培养液变黄，再次对初检阳性孔做ELISA检测；

(6)将两次检测均为强阳性的孔内细胞进行2-3次亚克隆，直到最后 一次所有仅一个细胞集落生长的培养孔上清ELISA检测结果均为阳性为 止；

(7)将最后一次有限稀释后ELISA检测结果最好的杂交瘤细胞克隆转 至24孔再扩大培养到6孔培养板，最后至100mL培养瓶收集细胞，冻存 强阳性单克隆杂交瘤细胞。

1.5单克隆抗体的制备

1.5.1腹水的制备

(1)选取10周龄BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL/只；

(2)7天后，腹腔接种经PBS稀释的培养至对数期的阳性杂交瘤细胞， 每只小鼠5×10⁵/mL杂交瘤细胞；

(3)5天后观察，当小鼠腹部明显膨胀时，用12号注射针头收集腹水， 每隔3天收集一次，直到小鼠死亡；

(4)将腹水以4000rpm，离心10min；留上清分装后-70℃冰箱保存。

1.5.2单克隆抗体的纯化(proteinA亲和层析)

(1)装柱：用EquilibrationBuffer(50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH8.6) 湿润柱子，检查柱子是否堵塞，加5mLProteinAAgarose于柱中；

(2)加入10倍柱体积的EquilibrationBuffer平衡柱子；

(3)使腹水缓慢流过凝胶床；如有必要，可将收集的流出液再次上柱；

(4)加入10倍柱体积的EquilibrationBuffer，按4-5mL/管收集穿透液直 至OD₂₈₀<0.1；

(5)准备收集管，收集洗脱液的试管按500μL/管加入中和缓冲液 (20mM磷酸盐缓冲液，pH7.7)。

(6)用5倍柱体积的ElutionBuffer(50mMglycine，0.5MNaCl，pH2.3) 洗脱，按1.5mL/管收集洗脱液直至OD₂₈₀<0.1；

(7)用5倍柱体积的EquilibrationBuffer洗柱及平衡柱子。

1.6单克隆抗体配对筛选

将所获得的132株纯化单抗两两组合，共得到(132×132)对组合，每 对组合中的两个抗体分别包被硝酸纤维素膜和标记胶体金，制备胶体金试 纸条，通过对G2-EPSPS重组抗原，G2-EPSPS转基因作物的灵敏性筛选， 对非转基因作物，非G2-EPSPS转基因作物的特异性筛选，最后筛选出只针 对G2-EPSPS高特异性高灵敏性的配对单抗。

1.6.1单克隆抗体的金标及膜制备

制备胶体金颗粒:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒。具体方法为: 用超纯水将氯金酸配制成0.01％水溶液，取100mL与1.2mL1％的柠檬酸三 钠水溶液混合，加热至沸腾并持续沸腾5min。冷却后用超纯水恢复至原体 积，制成颗粒直径约为30nm的胶体金颗粒。

确定胶体金标记的抗体最适稳定量：采用经典MEY法确定标记1mL 胶体金所需要的抗体用量为18μg。

硝酸纤维素膜(NC)的包被：用0.0lMpH7.2的PBS缓冲液稀释纯化 单抗至2mg/mL，用于包被T线，用0.0lMpH7.2的PBS缓冲液稀释羊抗 鼠IgG至lmg/mL，用于包被C线。用BIODOT公司XYZ3050工作系统以 30mm/s速度喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测T线和质控C线， 37℃烘干。

1.6.2免疫胶体金试纸的组装

将包被了C线5和T线4的硝酸纤维素膜6，吸收垫7，胶体金垫3以 及样品垫1依次粘附于不吸水的PVC被衬底板2上，如图3组装成免疫胶 体金试纸。

1.6.3单克隆抗体的配对筛选

132株单克隆抗体，一共获得132×132组配对单克隆抗体，组合成 132×132(17424)种胶体金试纸条。检测以ddH₂O作为阴性样本，重组 G2-EPSPS蛋白1μg/mL,转G2-EPSPS玉米种子抽提物0.2g/mL作为阳性 样本，转CP4-EPSPS大豆RRSoybean及转BT玉米BT2836种子抽提物0.2 g/mL作为交叉反应检测样本，对每一种试纸条进行测试。将针对重组 G2-EPSPS蛋白，转G2-EPSPS玉米种子抽提物呈阳性反应，而对其他样本 呈阴性反应的19株，37对配对单克隆抗体筛选出来作为候选的配对单抗。 对于候选的配对单抗，进一步检测其对重组G2-EPSPS及转G2-EPSPS作物 的检测灵敏度和对其他常见的非转基因作物和非G2-EPSPS的转基因作物的 特异性。选择对重组G2-EPSPS蛋白检测灵敏度达到1ng/mL水平，对转 G2-EPSPS作物种子检测达到0.2μg/mL水平，与90％的非转基因及非 G2-EPSPS转基因作物没有交叉反应的配对单克隆抗体作为制备双抗体夹心 法检测试剂盒的配对单克隆抗体。实验最终得到第一单克隆抗体1BH3和第 二单克隆抗体2EA2。

1.7单克隆抗体亚类的鉴定

利用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒(SouthernBiotech公司)对各株单 抗进行亚类鉴定，具体试验方法如下：

(1)重组G2-EPSPS蛋白5μg/mL包被酶标板，每孔100μL，37℃ 过夜；

(2)次日，甩掉未结合的蛋白，PBST洗涤3次，每次5min；每孔加 入100μL的0.5％BSA封闭，37℃放置1h；

(3)在封闭好的酶标板中分别加入1:1000倍稀释的纯化单克隆抗体， 100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次5min；

(4)向酶标板中依次加入用PBS1:250稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗 (分别为抗鼠κ、λ、IgM、IgA、IgG₁、IgG_2a、IgG_2b和IgG₃)，100μL/孔， 37℃放置1h，PBST洗涤3次，每次5min；

(5)37℃孵育30min，弃二抗。充分洗板后每孔加TMB100μL显色 15min，再加入1NH₂SO₄50μL/孔终止反应。测定OD₄₅₀值。

2.实验数据及结果

2.1单克隆抗体亚类的鉴定结果

各单抗重链结果如表8所示；轻链均为Kappa链

表8

抗体 1BH3 2EA2 抗体亚类 IgG2a IgG2b

2.2配对抗体灵敏度评价

本实验筛选到的配对单克隆抗体：第一单克隆抗体1BH3和第二单克隆 抗体2EA2，对重组G2-EPSPS蛋白检测灵敏度达1ng/mL；对转G2-EPSPS 水稻种子的检测灵敏度可达0.2μg/mL；对转G2-EPSPS玉米的检测灵敏度 较对转G2-EPSPS水稻种子的灵敏度稍低，但仍可达2μg/mL水平；对转 G2-EPSPS玉米叶片有弱反应(图1)。

表9

膜包被抗体(第一单克隆抗体) 1BH3 胶体金标记抗体(第二单克隆抗体) 2EA2 ddH₂O - rG2 1μg/mL +++ rG2 100ng/mL ++ rG2 10ng/mL ++ rG2 1ng/mL + G2水稻0.2g/mL +++ G2水稻20μg/mL ++ G2水稻2μg/mL + G2水稻0.2μg/mL ± G2玉米0.2g/mL +++ G2玉米20μg/mL +±

G2玉米2μg/mL + G2玉米0.2μg/mL - G2玉米叶0.2g/mL ±

2.3配对抗体特异性评价

本实验筛选到的配对单克隆抗体：第一单克隆抗体1BH3和第二单克隆 抗体2EA2，对27种非转基因作物和14种不同来源的各种非G2-EPSPS转 基因作物(表10)做了特异性检测实验。检测结果如图2及表10示。

配对单克隆抗体1BH3-2EA2对所有检测非转基因和非G2-EPSPS转基 因作物没有交叉反应。对转CP4-EPSPS的大豆和玉米没有交叉反应。

综上所述，配对单克隆抗体1BH3-2EA2制备的检测试纸条对大部分非 转基因和非G2-EPSPS转基因作物没有交叉反应。对转CP4-EPSPS的大豆和 玉米没有交叉反应。将产1BH3单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行保藏，保藏 编号为CGMCCNO.10495；将产2EA2单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行保 藏，保藏编号为CGMCCNO.10494。

表10

膜包被抗体(第一单克隆抗体) 1BH3 胶体金标记抗体(第二单克隆抗体) 2EA2 ddH₂O - No1 RR soybean - No2 Non-GMO corn - No3 Green peas - No4 Green lentils - No5 white bean - No6 Calico popcorn -

No7 Golden Jubilee - No8 Bodacious - No9 Sugar dots - No10 Seneca Horizon - No11 Pink Popcorn - No12 Corn seneca Snowshoe - No13 Corn Double Up - No14 Liberty Link NX3251 BT - No15 Mz2866 BT Mon 810 - No16 Pickseed 2733 - No17 Pickseed RR2565 - No18 Market Black eye bean - No19 Market Chana dal - No20 Market Green bean - No21 Market Turtle bean - No22 Market Green lentils - No23 Market Pinto bean - No24 Market Soya bean - No25 Market Chick peas - No26 Market Red kidney - No27 Market Lima bean - No28 Market Pot barley - No29 BT2735 corn - No30 BT Cotton 1# - No31 BT Cotton 2# -

No32 BT 2735Corn - No33 RR Soybean - No34 IrrE leaf - No35 Phy corn - No36 NAT leaf - No37 Bar leaf - No38 Hyg leaf - No39 NPTII leaf - No40 BT/CPTI Cotton - No41 RRcorn -

根据实施例2可以看出，本发明筛选到了一对单克隆抗体，能够通过免 疫胶体金试纸，对重组G2-EPSPS蛋白检测灵敏度达1ng/mL，对转 G2-EPSPS作物种子的检测灵敏度可达2μg/mL；对CP4-EPSPS蛋白不呈现 交叉反应，并且对27种非转基因作物和14种不同来源的各种非G2-EPSPS 转基因作物也不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述 实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技 术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不 必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要 其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。