肠道菌群失调致肺部过敏反应作用机制的实验研究

摘要

背景与目的：支气管哮喘是儿童最常见的慢性变应性疾病，在过去三十年中的发病率呈逐渐上升趋势，严重影响了儿童尤其是婴幼儿的生活质量，已成为全球关注的公共卫生问题。人体肠道正常菌群对机体具有重要的生理意义，临床上导致肠道菌群失调的最常见原因是抗生素的使用。近年来我国各级医疗机构的抗生素滥用现象十分普遍，因而肠道菌群失调就变得较为常见。人类流行病学调查表明在婴幼儿时期有抗生素暴露史者则以后发生哮喘的危险性增高，相关动物实验也提示抗生素所致肠道菌群失调与变应性疾病的发生相关。
　　 Th17细胞是继Th1、Th2之后新近发现的第三类效应性T细胞，无论临床研究还是动物实验，大量结果均提示Th17在哮喘发生中起到重要作用。近年来，免疫细胞的效应一调节功能失衡亦成为过敏性疾病研究中的重要内容，调节性T细胞（Treg）亚群的调节功能不足，可能是哮喘等变应性疾病发生的重要机制。此外，树突细胞（DC）在机体免疫系统中处于中心地位。作为一种专职抗原提呈细胞，DC可经其膜表面的Toll样受体（TLR）等来识别各种微生物的病原相关分子模式（PAMP），通过提呈抗原和分泌相应细胞因子，进而在指导Th0细胞分化为Th1、Th2、Th17、Treg细胞的过程中发挥了重要作用。
　　 在前期研究基础之上，我们拟采用卵清蛋白（OVA）雾化吸入气道激发，以进一步证实Th2优势反应的发生；明确在肠道菌群失调致肺部过敏反应过程中是否存在着Th1/Th2/Th17/Treg平衡的失调；并在肠道菌群失调状态下观察肺组织中树突细胞（DC）功能状态的变化情况。本研究结果将进一步阐明T细胞亚群尤其是Th17/Treg平衡以及树突细胞在肠道菌群失调致肺部过敏反应发生过程中的作用，可为哮喘等变应性疾病的防治提供新的思路和理论依据。
　　 第一部分、卵清蛋白雾化吸入诱导肠道菌群失调小鼠肺部过敏反应的发生
　　 目的：在抗生素所致肠道菌群失调小鼠模型基础上采用卵清蛋白（OVA）直接雾化吸入激发，探讨气道变应性反应与肠道菌群失调的关系，以期为后续实验打下良好的动物模型基础。
　　 方法：将112只雌性BALB/c小鼠随机分为两批6组，第一批：菌群失调Ⅰ组、对照Ⅰ组；第二批：菌群失调Ⅱ组、菌群失调加激发组、激发组、对照Ⅱ组。前2组和后4组小鼠分别于造模第6天和第14天时取盲肠内容物做肠道细菌培养计数。后4组小鼠在第14天时还要对其支气管肺泡灌洗液（BALF）进行细胞分类计数，观察肺组织病理形态学的变化情况，采用流式细胞术检测肺组织中Th1及Th2细胞水平，并用ELISA法检测BALF和血清中OVA特异性IgE的水平。
　　 结果：与对照Ⅰ组比较，自由饮用抗生素的小鼠出现肠道菌群失调，第6天时肠道细菌培养未见明显菌落生长，在第14天时肠道菌群失调仍未恢复正常。菌群失调加激发组小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数、淋巴细胞、嗜酸粒细胞和中性粒细胞均增加，肺部出现以嗜酸粒细胞和淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，肺组织黏液分泌明显增高，BALF中OVA特异性IgE水平显著增高，肺部Th2细胞水平增高，Th1细胞水平与对照Ⅱ组无差异，但Th1/Th2比值降低。
　　 结论：抗生素所致肠道菌群失调小鼠经过卵清蛋白雾化吸入激发后，可产生Th2细胞占优势的变应性气道反应，提示抗生素所致肠道菌群失调可能是诱发哮喘等变应性疾病的危险因素之一。
　　 第二部分、卵清蛋白气道激发对肠道菌群失调小鼠T细胞功能亚群的影响
　　 目的：观察抗生素所致肠道菌群失调小鼠经OVA气道激发后，肺组织和脾脏中T淋巴细胞功能亚群（Th1/Th2/Th17/treg）之间的相互变化，进一步探讨肠道菌群失调致肺部过敏反应发生这一现象在T细胞水平的作用机制。
　　 方法：将96只雌性BALB/c小鼠随机分为4组，菌群失调组、菌群失调加激发组、激发组、对照组，每组24只。于实验第14天时用ELISA法检测BALF中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10的水平，用RT-PCR法检测肺组织中特异性转录因子RORγt和Foxp3两者的mRNA表达水平，并采用流式细胞术检测肺组织及脾脏中Th1、Th2、Th17以及CD4+CD25+Foxp3+Treg的水平。
　　 结果：菌群失调加激发组小鼠BMLF中IL-4和IL-17水平增高，而IFN-γ和IL-10水平在各组间比较均无差异。菌群失调组及菌群失调加激发组小鼠肺组织中RORγt mRNA表达增加，而Foxp3 mRNA表达降低。菌群失调加激发组小鼠肺组织中Th1细胞水平无变化，而Th2、Th17细胞水平均增高；脾脏中Th1、Th2、Th17细胞水平均与对照组无差异。此外，菌群失调组及菌群失调加激发组小鼠肺组织及脾脏中Treg水平均降低。
　　 结论：抗生素所致肠道菌群失调小鼠经OVA雾化吸入激发后，肺部免疫状态在mRNA水平发生了潜在性改变，此外还可产生。Th2、Th17细胞均占优势的变应性气道反应，这可能与Treg细胞的产生数量减少以及调节功能不足有关。
　　 第三部分、肠道菌群失调小鼠树突细胞功能状态变化对肺部过敏反应的影响
　　 目的：观察抗生素所致肠道菌群失调对小鼠肺组织中树突细胞（DC）成熟度和Toll样受体2、4的影响，以深入探讨OVA气道激发引起肺部发生过敏反应在抗原提呈细胞水平的作用机制。
　　 方法：将64只雌性BALB/c小鼠随机分为4组，菌群失调组、菌群失调加激发组、激发组、对照组，每组16只。于实验第14天时用流式细胞术检测肺组织中树突细胞亚型和成熟度（MHC-Ⅱ类分子）及其膜表面Toll样受体2、4的表达水平，采用免疫组织化学法检测肺组织中TGF-β1、IL-6蛋白的原位表达情况，并用ELISA法检测BALF中TGF-β1、IL-6的产生水平。
　　 结果：与对照组和激发组比较，菌群失调组及菌群失调加激发组小鼠肺组织中树突细胞膜表面MHC-Ⅱ类分子及TLR2、4的表达均增加，但其在后两组中的表达差异无统计学意义。与其它3组比较，菌群失调加激发组小鼠肺组织中TGF-β1、IL-6蛋白的原位表达增高，且BALF中TGF-β1、IL-6水平亦同步增加。
　　 结论：肠道菌群失调使得肺部树突细胞的成熟度增高，且抗原提呈能力增强，当呼吸道受到变应原OVA激发后，成熟树突细胞可调节Th0向Th17分化，就有可能引起肺部过敏反应的发生。