粉防已碱对偏头痛大鼠三叉神经节卫星胶质细胞炎症的影响及其机制的研究

摘要

目的:偏头痛确切的发病机制目前尚不清楚,但三叉神经系统的激活以及随之产生释放的神经化学物质在其机制中仍起主导作用。近年来关于卫星胶质细胞的激活分泌释放炎症因子影响了偏头痛的发生发展得到广泛的认可,因此,卫星胶质细胞在偏头痛中的作用成为了研究的热点。核转录因子(nuclear factor-kB,NF-kB)在炎症反应中起中心调控作用,其靶基因多位于脑血管内皮细胞、神经细胞和胶质细胞。研究发现硝酸甘油(nitroglycerin,GTN)可以诱导偏头痛大鼠三叉神经尾核神经元内的NF-kB激活,随而导致细胞因子的转录激活,促进了偏头痛发作时的炎症反应。因此,我们推测NF-kB的激活对于卫星胶质细胞分泌释放炎症因子同样至关重要。长久以来对于偏头痛的治疗一直是人们探索的热点,寻找一种副作用低、针对偏头痛多种发病机制均有效的药物成为治疗偏头痛的首要任务。中药粉防己碱(Tetrandrine,简称Tet)是从防己科植物粉防己根中提取的双苄基异喹啉类生物碱,是一种天然的钙通道阻滞剂,并具有消炎镇痛的作用。因此,预测Tet有可能减少三叉神经节(trigeminal ganglia,简称TG)炎症因子的产生,对偏头痛起到保护作用。本课题利用GTN建立三叉神经节卫星胶质细胞激活模型和偏头痛模型,以对细胞因子起调节作用的NF-kB作为切入点,研究Tet是如何调节NF-kB的表达,以期为偏头痛的临床治疗寻找到一个有效的神经保护剂。
　　 方法:
　　 1.体外纯化培养1-3天Sprague-Dawley(SD)大鼠三叉部位卫星胶质细胞,用不同浓度的GTN作用于卫星胶质细胞,应用Alarm blue检测细胞存活情况,筛选出最适宜的激活细胞的GTN浓度;应用RT-PCR检测激活后的细胞内炎症因子的产生情况;
　　 2.应用不同浓度的Tet作用于激活的卫星胶质细胞,应用Alarmblue检测细胞存活情况,筛选出最佳的Tet治疗浓度。利用筛选出的最适宜的0.55 mmol/L GTN分别作用于卫星胶质细胞4,6,12h后,应用FQ-PCR检测NF-kB以及炎症因子IL-1β mRNA的表达,确定哪个时间点NF-kB及IL-1β mRNA表达最强;
　　 3.细胞实验分为正常对照组(CON组):正常培养卫星胶质细胞,未作任何处理;GTN组:0.55mmol/L GTN与卫星胶质细胞共培养4h;Tet治疗组(Tet+GTN组):10-7mol/L Tet与0.55mmol/L GTN按1:1比例分别加入卫星胶质细胞内共同培养4h。应用FQ-PCR和免疫荧光分别从mRNA和蛋白水平检测Tet对GTN诱导激活的卫星胶质细胞内NF-和IL-1β表达的影响。Fluo-3/AM探针负载后,检测卫星胶质细胞内钙离子浓度变化,探讨Tet对调节炎症因子变化的分子机制;
　　 4.动物实验分为正常对照组:正常大鼠腹部注射生理盐水;GTN组:正常大鼠颈背部注射GTN(10mg/kg);高浓度Tet+GTN组:正常大鼠腹部注射Tet(50mg/kg),30分钟后颈背部注射GTN(10mg/kg);低浓度Tet+GTN组:正常大鼠腹部注射Tet(10mg/kg),30分钟后颈背部注射GTN(10mg/kg)。观察各组大鼠的行为学变化。应用FQ-PCR、免疫荧光和Western blot同时从mRNA和蛋白水平检测各实验组三叉神经节内NF-kB和IL-1β的变化。Fluo-3/AM探针负载后,检测各组大鼠三叉神经节内钙离子浓度变化,从整体上探讨Tet对调节炎症因子变化的分子机制。
　　 结果:
　　 1.硝酸甘油刺激最佳浓度的筛选:通过Alarm blue检测细胞存活情况,其中0.55、1.1和2.2mmol/L三种浓度硝酸甘油刺激星型胶质细胞后活力明显降低(P＜0.05),但从细胞活力和形态上观察以0.55mmol/L硝酸甘油为最佳浓度;RT-PCR结果显示:0.55mmol/L硝酸甘油刺激细胞后,IL-1β和TNF-αmRNA表达增高(P＜0.05)。
　　 2.通过Alarm blue筛选出Tet的最适宜治疗浓度为10-7mol/L;0.55mmol/L GTN分别与细胞共培养4h、6h、12h后,通过FQ-PCR检测出4h时NF-kB和IL-1β mRNA表达最高(P＜0.05)。
　　 3.细胞实验结果表明:通过FQ-PCR和免疫荧光检测发现,GTN诱导卫星胶质细胞内NF-kB的激活,细胞内NF-kB和IL-β的表达增高(P＜0.05);而Tet治疗组,细胞内NF-kB和IL-1β的表达降低(P＜0.05)。Tet可以抑制GTN诱导的卫星胶质细胞内[ca2+]I增高(P＜0.05)。
　　 4.动物实验结果显示:Tet治疗后,模型组偏头痛大鼠挠头次数显著降低(P＜0.05);FQ-PCR、免疫荧光和Western blot结果表明:GTN组三叉神经节内NF-kB和IL-1β的表达与正常对照组比较明显增高(P＜0.05),而Tet治疗组偏头痛大鼠三叉神经节内NFkB和IL-1β的表达降低(P＜0.05)。各实验组钙离子的表达情况基本上与NF-kB和IL-1β表达一致。
　　 结论:
　　 1.本实验利用GTN诱导三叉神经节卫星胶质细胞激活建立的三叉神经节炎症模型稳定、成功,可方便有效的模拟离体偏头痛发作时的炎症表现。
　　 2.NF-kB在三叉神经节卫星胶质细胞内激活调节炎症因子IL-1β的释放。
　　 3.Tet可以通过阻断星形胶质细胞内钙离子内流调控NF-kB的表达,从而减少炎症因子IL-1β的释放。