小鼠结肠癌细胞PARG对肿瘤淋巴管生成的影响及其分子机制研究

摘要

第一部分、小鼠结肠癌CT26细胞PARG对肿瘤淋巴管形成影响的离体研究
　　 目的：探讨小鼠结肠癌CT26细胞多聚(腺苷二磷酸核糖)水解酶[poly-(ADP-ribose)glycohydrolase,PARG]对淋巴管内皮细胞淋巴管形成能力的影响。
　　 方法：将慢病毒载体介导的PARG－shRNA(Lentivirus Vector-mediatedPARG-shRNA,LV-PARG-shRNA)和PARG-cDNA(LentivirusVector-mediated PARG-cDNA,LV-PARG-cDNA)分别转染小鼠结肠癌CT26细胞,以转染慢病毒空载体CT26细胞和未进行转染的CT26细胞为对照,Western blot法检测各组细胞PARG蛋白表达,荧光定量PCR法检测各组细胞PARG mRNA表达。应用不完全弗氏佐剂(incomplete Freund's adjuvant,IFA)诱导BALB/C小鼠形成良性淋巴管瘤,分离淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cell,LEC);应用细胞免疫荧光检测Podoplanin表达,鉴定获取的淋巴管内皮细胞;以转染慢病毒空载体CT26细胞和未进行转染的CT26细胞为对照,Transwell细胞迁移实验检测转染LV-PARG-shRNA后的CT26细胞(CT26-PARG-shRNA)和转染LV-PARG-cDNA后的CT26细胞(CT26-PARG-cDNA)对淋巴管内皮细胞迁移的影响,淋巴管形成实验检测转染LV-PARG-shRNA后的CT26细胞和转染LV-PARG-cDNA后的CT26细胞对淋巴管内皮细胞形成管腔能力的影响。
　　 结果：
　　 1.荧光定量PCR和Western blot结果显示,LV-PARG-shRNA转染后CT26细胞PARG mRNA和蛋白表达较对照组显著降低(P＜0.01);LV-PARG-cDNA转染后CT26细胞PARG mRNA和蛋白表达较对照组显著增高(P＜0.01);转染慢病毒空载体CT26细胞和未进行转染的CT26细胞比较,PARG mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 2.成功建立BALB/C小鼠良性淋巴管瘤模型;细胞免疫荧光结果显示提取的细胞均阳性表达Podoplanin,表明成功获取淋巴管内皮细胞。
　　 3.Transwell细胞迁移实验结果表明CT26-PARG-shRNA细胞组迁移的淋巴管内皮细胞较对照组显著减少(P＜0.01);而CT26-PARG-cDNA细胞组迁移的淋巴管内皮细胞较对照组显著增多(P＜0.01);未进行转染的CT26细胞组和转染慢病毒空载体CT26细胞组相比,迁移的淋巴管内皮细胞差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 4.淋巴管管腔形成实验结果显示,CT26-PARG-shRNA细胞组形成的淋巴管分支数量较对照组显著减少(P＜0.01);而CT26-PARG-cDNA细胞组形成的淋巴管分支数量较对照组显著增多(P＜0.01);未进行转染的CT26细胞组和转染慢病毒空载体CT26细胞组相比,淋巴管分支数量差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 1.成功获得了PARG基因沉默的小鼠结肠癌CT26细胞(CT26-PARG-shRNA)和PARG基因过表达的小鼠结肠癌CT26细胞(CT26-PARG-cDNA)。
　　 2.小鼠结肠癌CT26细胞PARG基因沉默可抑制LEC迁移和淋巴管腔形成;而PARG基因过表达可增强LEC的迁移和淋巴管腔形成。提示小鼠结肠癌细胞PARG可影响LEC淋巴管的形成能力,其可能在促进大肠癌肿瘤淋巴管形成过程中发挥重要作用。
　　 第二部分、小鼠结肠癌CT26细胞PARG对肿瘤淋巴管形成影响的在体研究
　　 目的：探讨小鼠结肠癌CT26细胞PARG对BALB/C小鼠移植瘤淋巴管生成的影响。
　　 方法：将CT26-PARG-shRNA细胞和CT26-PARG-cDNA细胞分别注射于BALB/C小鼠左腋窝附近,以注射未进行转染的CT26细胞和转染慢病毒空载体的CT26细胞为对照,观察移植瘤在小鼠体内生长情况;免疫组织化学法检测移植瘤组织的淋巴管生成并进行淋巴管密度计数。
　　 结果：
　　 1.CT26-PARG-shRNA细胞组移植瘤体平均重量较对照组显著降低(P＜0.01);CT26-PARG-cDNA细胞组移植瘤体平均重量较对照组显著增高(P＜0.01);未进行转染的CT26细胞组和转染慢病毒空载体的CT26细胞组相比,移植瘤体重量无显著性差异(P＞0.05)。
　　 2.免疫组织化学结果显示,CT26-PARG-shRNA细胞组移植瘤淋巴管密度显著低于对照组(P＜0.01);CT26-PARG-cDNA细胞组移植瘤淋巴管密度显著高于对照组(P＜0.01);未进行转染的CT26细胞组和转染慢病毒空载体的CT26细胞组相比较无统计学意义(P＞0.05)。
　　 结论：小鼠结肠癌CT26细胞PARG基因沉默在BALB/C小鼠体内可显著抑制肿瘤淋巴管的生成,而PARG基因过表达可显著促进肿瘤淋巴管的生成,小鼠结肠癌CT26细胞PARG对肿瘤淋巴管形成具有调节作用,PARG在肿瘤转移中可能发挥重要作用。
　　 第三部分、小鼠结肠癌CT26细胞PARG抑制对VEGF-C蛋白表达的影响
　　 目的：初步探讨PARG抑制对小鼠结肠癌CT26细胞血管内皮生长因子C(Vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)蛋白表达影响。
　　 方法：应用PARG抑制剂单宁酸(Gallotannin,GLTN)处理小鼠结肠癌CT26细胞,以GLTN未处理组作为对照。Western blot法检测细胞PARG、NF-kBp65及VEGF-C蛋白表达;RT-PCR法检测细胞VEGF-CmRNA表达;ELISA法检测细胞培养上清液VEGF-蛋白分泌量。
　　 结果：Western blot结果显示,GLTN处理组小鼠结肠癌CT26细胞PARG表达较对照组明显下降(P＜0.01),NF-kBp65和VEGF-C表达较对照组亦明显降低(P＜0.05)。RT-PCR结果显示GLTN处理组小鼠结肠癌CT26细胞VEGF-C mRNA表达较对照组明显降低(P＜0.01)。ELISA结果显示GLTN处理组小鼠结肠癌CT26细胞VEGF-C蛋白分泌量较对照组明显降低(P＜0.05)。
　　 结论：小鼠结肠癌CT26细胞PARG抑制可降低VEGF-C表达及分泌,这可能与PARG抑制后下调NF-kB活性有关。
　　 第四部分、小鼠结肠癌CT26细胞PARG对VEGF-C蛋白表达调控机制研究目的探讨PARG影响小鼠结肠癌CT26细胞VEGF-C表达的调控机制。
　　 方法：以未进行转染的CT26细胞移植瘤和转染慢病毒空载体的CT26细胞移植瘤为对照,Western blot法检测CT26-PARG-shRNA细胞移植瘤和CT26-PARG-cDNA细胞移植瘤组织PARG、p-ERK、p-p38、NF-kBp65和VEGF-C蛋白表达;荧光定量PCR法检测各组移植瘤VEGF-C mRNA表达。以转染慢病毒空载体小鼠结肠癌CT26细胞及未进行转染的小鼠结肠癌CT26细胞为对照,Western blot法检测转染LV-PARG-shRNA后的CT26细胞和转染LV-PARG-cDNA后的CT26细胞PARG、p-ERK、p-p38、NF-KBp65和VEGF-C蛋白表达。ELISA法检测各组细胞VEGF-C蛋白的分泌量。为进一步探讨ERK和p38细胞信号通路与NF-kB、VEGF-C的关系以及NF-kB与VEGF-C的关系,采用ERK抑制剂(U126)、p38抑制剂(SB203580)和NF-kB抑制剂(PDTC)分别处理LV-PARG-cDNA转染后CT26细胞,Western blot法检测NF-kBp65、VEGF-C表达变化,ELISA法检测细胞VEGF-C蛋白分泌量。
　　 结果：
　　 1.Western blot结果显示,CT26-PARG-shRNA细胞组移植瘤PARG、p-ERK、p-p38、NF-kBp65和VEGF-C蛋白表达显著低于对照组(P＜0.01,P＜0.05);CT26-PARG-cDNA细胞组移植瘤PARG、p-ERK、p-p38、NF-kBp65和VEGF-C蛋白表达显著高于对照组(P＜0.01,P＜0.05)。未进行转染的CT26细胞组和转染慢病毒空载体的CT26细胞组移植瘤PARG、p-ERK、p-p38、NF-kB3p65和VEGF-C蛋白表达相比,均无显著性差异(P＞0.05)。转染LV-PARG-shRNA后CT26细胞p-ERK、p-p38、NF-kBp65和VEGF-C表达也明显低于对照组(P＜0.01);而转染LV-PARG-cDNA后CT26细胞p-ERK、p-p38、NF-kBp65和VEGF-C较对照组表达明显增强(P＜0.01)。转染慢病毒空载体CT26细胞和未进行转染的CT26细胞p-ERK、P-p38、NF-kBp65和VEGF-C表达相比,差异均无统计学意义(P＞0.05)。分别应用ERK抑制剂(U126)和p38抑制剂(SB203580)处理转染LV-PARG-cDNACT26细胞后,其NF-kBp65表达较未用抑制剂处理的转染LV-PARG-cDNA CT26细胞有显著下降(P＜0.01);应用ERK抑制剂(U126)、p38抑制剂(SB203580)和NF-KB抑制剂(PDTC)分别处理转染LV-PARG-cDNA CT26细胞后,其VEGF-C表达较未用抑制剂处理的转染LV-PARG-cDNA CT26细胞显著降低(P＜0.01)。
　　 2.荧光定量PCR结果显示,CT26-PARG-shRNA细胞组移植瘤VEGF-C mRNA表达水平显著低于对照组(P＜0.01);CT26-PARG-cDNA细胞组移植瘤VEGF-C mRNA表达水平显著高于对照组(P＜0.01),差异具有统计学意义;未进行转染的CT26细胞组和转染慢病毒空载体的CT26细胞组相移植瘤VEGF-C mRNA表达差异无显著性(P＞0.05)。
　　 3.ELISA结果显示,转染LV-PARG-shRNA后CT26细胞VEGF-C蛋白分泌量较对照组显著降低(P＜0.01),而LV-PARG-cDNA转染后CT26细胞VEGF-C蛋白分泌量较对照组显著增高(P＜0.01),转染慢病毒空载体CT26细胞和未进行转染的CT26细胞VEGF-C蛋白分泌量差异无统计学意义((P＞0.05)。ERK抑制剂(U126)、p38抑制剂(SB203580)和NF-kB抑制剂(PDTC)分别处理转染LV-PARG-cDNA后的CT26细胞的VEGF-C蛋白分泌量较未用抑制剂处理的转染LV-PARG-cDNA后的CT26细胞的蛋白分泌量显著降低(P＜0.01)。
　　 结论：小鼠结肠癌CT26细胞PARG基因沉默可以降低p-ERK、p-p38、NF-kBp65和VEGF-C的表达,并降低VEGF-C的分泌:CT26细胞PARG基因过表达可以增强p-ERK、p-p38、NF-kBp65和VEGF-C的表达,并促进VEGF-C的分泌。ERK抑制和p38抑制可以分别抑制PARG基因过表达CT26细胞NF-kBp65、VEGF-C表达及VEGF-C分泌,NF-kB抑制可以抑制PARG基因过表达CT26细胞VEGF-C表达及VEGF-C分泌,提示在小鼠结肠癌CT26细胞中PARG可通过ERK、p38和NF-kB信号通路调控VEGF-C蛋白表达,进而对肿瘤淋巴管形成发挥调节作用。