姜黄素干预酒精对心肌细胞H3K9高乙酰化失衡及基因表达失衡

摘要

目的:
　　 孕期酒精暴露可能诱发先天性心脏病(Congenital heart disease,简称先心病)的发生,但其致病机制目前仍不清楚。本课题组前期研究发现酒精可选择性引起心肌祖细胞15-13(Cardiac progenitor cellsl5-13,CP15-13)组蛋白H3第9位赖氨酸(Histone H3 lysine9,H3K9)高乙酰化失衡,使其下游心脏发育相关基因的表达升高。推测这可能是酒精导致先心病发生的机制之一。为进一步证实酒精对心肌祖细胞组蛋白H3K9的表突变作用以及探讨其可逆和可干预的特征,本研究采用特异性乙酰化酶(Histone acetyltransferases,HATs)抑制剂—姜黄素(Curcumin)来干预和改善酒精导致的H3K9高乙酰化和相关基因的表达异常,为表观遗传所致的表突变可逆性干预提供了实验依据。
　　 材料与方法:
　　 复苏心肌祖细胞,用含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基在CO2孵箱中培养,待细胞贴满瓶底约80～90%时1:3比例传代。分组对细胞进行处理:在培养基中加入200mM浓度酒精的为酒精组;将姜黄素分别以5,15,25,35μM的浓度溶解于200mM酒精中加入培养基为5μM,15μM,25μM,35μM姜黄素组;对照组为不加药的心肌祖细胞。用MTT比色法来初步筛选心肌祖细胞对姜黄素可耐受的有效浓度范围。应用Western blot检测对心肌祖细胞进行药物处理前后组蛋白H3K9乙酰化水平的改变,筛选出姜黄素的有效干预浓度。采用荧光定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)方法检测在姜黄素有效干预浓度下心肌祖细胞心脏发育相关基因GATA4,Mef2c,Tbx5表达量的变化。
　　 结果:
　　 1.MTT结果显示200mM酒精组抑制心肌祖细胞增殖率28%;5,15,25,35μM姜黄素组抑制心肌祖细胞增值率分别是30%,33%,37%,52%。35μM姜黄素可达到细胞半数死亡率,遂以5,15,25μM作为心肌祖细胞对姜黄素可耐受的有效浓度范围。
　　 2.对组蛋白H3K9乙酰化水平及心脏发育相关基因表达水平进行Western blot法和Q-PCR法检测。200mM酒精使组蛋白H3K9乙酰化水平较对照组升高2.76倍(P＜0.05),同时心脏发育相关基因GATA4,Mef2c.Tbx5表达均增加,其中GATA4,Mef2c较对照组有统计学差异(P＜0.05)。5,15,25μM姜黄素分别使组蛋白H3K9乙酰化水平较酒精组降低了20%(P＞0.05),43%(P＜0.05),63%(P＜0.05);并且,25μM姜黄素组使组蛋白H3K9乙酰化水平及心脏发育相关基因GATA4,Mef2c,Tbx5表达降至对照组水平(P＞0.05)。
　　 结论:
　　 1.酒精和姜黄素均对心肌祖细胞有毒性作用。
　　 2.姜黄素可改善酒精导致的心肌祖细胞组蛋白H3K9的高乙酰化状态以及心脏发育相关基因的过表达。