人PRR11和FAM33A基因双向启动子的初步鉴定与分析

摘要

PRR11(Proline-rich protein11,PRR11)是我们最近发现的一个新的肿瘤相关基因,初步研究表明其参与细胞增殖、细胞周期和细胞癌变等多种生物学过程。生物信息学分析表明,该基因的上游紧邻基因FAM33A(family with sequence similarity33 A)也是一个最近鉴定的参与细胞增殖和细胞周期的肿瘤相关基因,且这两个基因的转录方向恰好相反,提示PRR11和FAM33A这两个基因可能共享一个双向启动子,作为一个完整的转录调控单元被调控。在本研究的前期工作中,采用5'RACE技术鉴定了PRR11和FAM33A基因的转录起始位点,接着采用PCR定向克隆和酶切亚克隆等方法,构建了覆盖PRR11和FAM33A基因5'端侧翼区附近大约2.0kb区域的一系列PRR11和FAM33A基因的启动子荧光素酶报告基因重组体。启动子活性分析表明,PRR11基因可能具有一个启动子,FAM33A基因可能具有两个启动子,其中一个启动子和PRR11基因启动子相互重叠,主要位于PRR11-P1496和PRR11-P594之间的区域(转录起始位点附近-563 bp～+341 bp的区域),提示PRR11和FAM33A基因共享一个双向启动子,从而作为一个完整的转录调控单元被调控。转录因子结合位点预测分析软件分析表明,PRR11和FAM33A基因启动子区域含有典型的GC盒,以及E2F、Sp1、Myb和GATA-1等潜在的转录因子结合位点,提示E2F和Sp1等转录因子可能参与PRR11和FAM33A基因的转录调控。
　　 为了进一步研究PRR11和FAM33A基因的转录调控机制并全面解析其功能,同时找出能够双向调节这对基因的核心双向启动子区域,本研究在前期工作的基础之上对PRR11和FAM33A基因的启动子区域进行了进一步的鉴定和分析。首先用PCR定向克隆的方法构建了FAM33A基因启动子R1269/F1959区域的荧光素酶报告基因重组体pGL3b-FAM33A-P688;然后用定点突变的方法,用前期工作中已经构建好的pGL3b-PRR11-P1496重组体为模板构建了荧光素酶报告基因重组体pGL3b-PRR11-P788。接着以构建成功的pGL3b-FAM33A-P688和pGL3b-PRR11-P788为模板,用定点突变的方法分别构建了pGL3b-FAM33A-P474、pGL3b-FAM33A-P436、pGL3b-PRR11-P574、pGL3b-PRR11-P536,最后又分别以以上四个重组体为模板,同样用定点突变的方法构建了pGL3b-FAM33A-P211、pGL3b-FAM33A-P80pGL3b-PRR11-P211、pGL3b-PRR11-P80。启动子活性分析结果表明,所构建的荧光素酶报告基因重组体均具有较强启动子活性,强烈提示PRR11和FAM33A基因共享一个双向启动子,且该双向启动子的核心区域被初步锁定于PRR11和FAM33A基因之间80 bp的最小区域(即pGL3b-PRR11-P80和pGL3b-FAM33A-P80重组体所包含的启动子序列片段)。