1.RNAi介导的Insig-1基因抑制对炎症小鼠脂质代谢的影响和分子机制研究;2.老年人非高密度脂蛋白胆固醇与冠心病相关性分析

摘要

实验一 RNAi介导的Insig-1基因抑制对炎症小鼠脂质代谢的影响和分子机制研究
　　 第一部分小鼠Insig-1基因siRNA表达质粒的构建、鉴定
　　 目的:构建针对小鼠Insig-1基因的siRNA表达质粒并鉴定其干扰效果。
　　 方法:利用Ambion公司的siRNA在线设计软件,设计针对小鼠Insig-1基因的三个干扰片段和一个阴性对照片段,插入到pGenesil-1中构建Insig-1的干扰质粒,分别命名为pGen-Insig-1-1(si-1)、pGen-Insig-1-2(si-2)、pGen-lnsig-1-3(si-3)及pGen-Insig-1-nc(si-nC)。酶切鉴定后送检测序。通过脂质体Lipofectamine2000将上述质粒分别瞬时转染小鼠RAW264.7细胞,利用反转录PCR技术(RT-PCR)和westernblot鉴定干扰效果,筛选出干扰作用最强的Insig-1表达质粒。
　　 结果:测序结果显示重组质粒中的插入序列与设计的寡核苷酸序列完全一致,表明已成功构建了针对Insig-1基因的siRNA表达质粒。经RT-PCR和western blot鉴定,构建的三个干扰质粒均能不同程度的抑制Insig-1基因表达,其中pGen-Insig-1-2干扰效果最强。
　　 结论:成功构建了针对Insig-1基因的3个siRNA表达质粒,并鉴定出沉默效果最强的干扰质粒
　　 第二部分 Insig-1基因沉默对炎症状态下RAW264.7小鼠巨噬细胞脂质代谢的影响
　　 目的:观察-RNAi沉默Insig-1基因对炎症状态下小鼠巨噬细胞RAW264.7脂质代谢的影响。
　　 方法:RAW264.7细胞接种于24孔板24小时,利用脂质体转染干扰载体pGen-Insig-1-2和pGen-Insig-1-nc,24小时后经G418筛选14天获得稳定转染细胞株。RT-PCR、western blot和免疫细胞化学鉴定稳定干扰株Insig-1的表达。不同浓度LDL和LPS负荷细胞下,western blot检测LDLr蛋白的表达,以确定LDL和LPS后续处理细胞的浓度。以筛选浓度的LDL和LPS共同刺激pGen-Insig-1-2/RAW264.7细胞和pGen-Insig-1-nc/RAW264.7细胞(以未转染RAW264.7细胞作阴性对照),利用酶学方法检测细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)的水平;油红O染色观察细胞内脂质积聚情况;提取细胞总RNA和总蛋白,应用RT-PCR和western blot检测Insig-1、SCAP、SREBP-2和LDLr的mRNA和蛋白表达水平。
　　 结果:干扰载体转染RAW264.7,经G418筛选后得到稳定干扰株,分别命名为pGen-Insig-1-2/RAW264.7细胞和pGen-Insig-1-nc/RAW264.7细胞,经RT-PCR、western blot和免疫细胞化学结果证实pGen-Insig-1-2/RAW264.7稳定干扰株内Insig-1mRNA和蛋白表达较pGen-Insig-1-nc/RAW264.7和未转染RAW264.7细胞显著降低(P＜0.05)。通过LDLr的蛋白表达筛选出处理细胞的LDL和LPS浓度分别为50μg/ml和200ng/ml。油红O染色结果显示当负荷50μg/mlLDL+200ng/ml LPS时,RAW264.7细胞内红染脂滴与未加高脂和炎症处理的RAW264.7细胞(空白对照)相比显著增多(P＜0.05);经同样条件刺激,pGen-Insig-1-2/RAW264.7细胞内红染脂滴与未转染RAW264.7细胞(阴性对照)相比显著增多;pGen-Insig-1-nc/RAW264.7细胞内红染脂滴与未转染RAW264.7细胞(阴性对照)无明显差异。胆固醇含量变化与油红O结果一致。RT-PCR、western blot显示50μg/ml LDL+200ng/ml LPS处理的RAW264.7细胞与未加高脂和炎症处理的RAW264.7细胞(空白对照)相比,SCAP、SREBP-2和LDLr mRNA和蛋白表达显著下降(P＜0.05);经同样条件刺激,pGen-Insig-1-2/RAW264.7细胞SCAP、SREBP-2和LDLr mRNA和蛋白的表达较未转染RAW264.7细胞(阴性对照)明显增加(P＜0.05);pGen-Insig-1-nc/RAW264.7细胞SCAP、SREBP-2和LDLr mRNA和蛋白的表达与未转染RAW264.7细胞无明显差异(P＞0.05)。
　　 结论:Insig-1基因沉默增强了炎症状态下RAW264,7小鼠巨噬细胞SCAP、SREBP-2、LDLr mRNA和蛋白表达,促进了小鼠巨噬细胞胆固醇的摄取,细胞脂质蓄积,发生泡沫样变。
　　 第三部分 Insig-1基因沉默致炎症小鼠组织脂质异常积聚的分子机制
　　 目的:观察RNAi沉默Insig-1基因对炎症状态下小鼠组织脂质代谢的影响和分子机制。
　　 方法:通过腹腔注射酪蛋白复制炎症小鼠动物模型并喂养高脂饮食(普通饮食并PBS注射为空白对照),ELLISA法测定血清IL-6和SAA浓度确定炎症模型。利用尾静脉注射法将干扰载体pGen-Insig-1-2和pGen-Insig-1-nc注入炎性C57BL/6纯系小鼠(未转染为阴性对照)。利用酶学方法检测小鼠血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三醋(TG)含量;油红O染色观察肝脏和肾脏内脂质积聚情况;提取肝脏细胞总RNA和总蛋白,应用RT-PCR和western blot检测SCAP、LDLr和SREBP-2的mRNA和蛋白表达水平。
　　 结果:酪蛋白注射和高脂饮食喂养后小鼠血清SAA水平较普通饮食加PBS注射组(空白对照)明显升高,差异有显著性(P＜0.05),IL-6水平轻度升高,差异无显著性(P＞0.05)。酪蛋白注射和高脂饮食喂养后小鼠血清TC、LDL-C、HDL-C及TG含量较普通饮食加PBS注射组(空白对照)显著升高(P＜0.05);酪蛋白注射和高脂饮食喂养的同时注射pGen-Insig-1干扰质粒,其中pGen-Insig-1-2组血浆TC、FC及CE水平较未注射质粒组(阴性对照)显著降低(P＜0.05);pGen-Insig-1-nc组血浆TC、FC及CE水平与未注射质粒组(阴性对照)无显著差异(P＞0.05)。小鼠肝脏和肾脏油红O显示普通饮食加PBS注射组肝脏和肾脏内少有红染;高脂饮食喂养和酪蛋白注射组肝、肾组织着色加深,见局灶性红染,提示部分细胞发生泡沫样变;高脂饮食喂养和酪蛋白注射同时注射Insig-1基因阳性质粒干扰组,组织内局灶性红染进一步加剧。RT-PCR和western blot结果显示高脂喂养和酪蛋白注射处理的小鼠与普通饮食加PBS注射组(空白对照)相比,肝脏SCAP、SREBP-2和LDLr mRNA表达增加(P＜0.05);经同样条件刺激,pGen-Insig-1-2组SCAP、SREBP-2和LDLr mRNA的表达较未注射质粒组(阴性对照)明显增加(P＜0.05);pGen-Insig-1-nc/组SCAP、SREBP-2和LDLr mRNA的表达与未注射质粒组(阴性对照)无明显差异(P＞0.05)。
　　 结论:Insig-1基因沉默增强了炎症状态下小鼠肝脏SCAP、SREBP-2、LDLr mRNA和蛋白表达,促进了肝、肾组织胆固醇的摄取,组织脂质异常蓄积,细胞发生泡沫样变。
　　 实验二老年人非高密度脂蛋白胆固醇与冠心病的相关性分析
　　 目的:探讨在老年人群non-HDL-C水平与冠心病及冠状动脉病变程度的相关性。
　　 方法:回顾性分析1272例行冠状动脉造影的老年患者。根据冠状动脉造影结果分为冠心病组和对照组,其中767例冠心病患者分别按冠状动脉病变支数及Gensini积分分组,测定血清TC、HDL-C、LDL-C、T-G,并计算出non-HDL-C。比较各组non-HDL-C的差异及与冠状动脉病变程度的相关性。
　　 结果:冠心病组non-HDL-C水平显著高于对照组(P＜0.01)。冠状动脉病变支数越多,血清non-HDL-C水平越高,以多支病变组升高最为明显,与1支病变组、2支病变组比较有统计学差异(P＜0.01,P＜0.05);冠状动脉病变狭窄程度越重,血清non-HDL-C水平也越高,以Gensini积分＞40分组升高最明显,与＜20分组、20～40分组比较有统计学差异(P＜0.01,P＜0.05);血清non-HDL-C水平与冠状动脉病变范围及严重程度呈正相关关系(r=0.147,P＜0.01;r=0.152,P＜0.01)。
　　 结论:在老年人群,血清non-HDL-C水平与冠心病的发生发展密切相关,对冠状动脉病变范围及严重程度具有很好的预测价值,是一项可用于评估冠心病风险的重要指标。