Chk1和p57/kip2对人卵巢癌细胞SKOV3及HO8910细胞周期调控的影响及机制研究

摘要

背景：卵巢恶性肿瘤是女性生殖道三大恶性肿瘤之一，其中85-90％为上皮性卵巢癌，上皮性卵巢癌在女性生殖道恶性肿瘤中死亡率最高，75％以上的患者初诊时已发展到中晚期，临床治疗主要采用手术切除及联合化疗，5年生存率在30％左右，至少70％患者会复发。卵巢癌发病机制不清，早期诊断困难，化疗耐药等多因素造成了卵巢癌治疗效果差。近年来的研究认为DNA损伤应答反应(DNA damage response，DDR)系统对肿瘤的发生、发展及治疗具有重要的作用，DDR功能紊乱是细胞癌变的关键因素，DDR因促进肿瘤细胞DNA损伤修复而降低了化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，与肿瘤耐药和复发密切相关。DDR是一个复杂的调控系统，主要包括：感应DNA损伤，通过对细胞周期的调控，让细胞周期阻滞在某个时相对DNA损伤进行修复，并调节凋亡和衰老，其中细胞周期的调控在DDR系统中起着核心作用。通过深入研究细胞周期的调控机制，并寻找细胞周期的调控机制中的关键因子作为抗癌治疗的靶点，是目前肿瘤治疗研究的热点之一。细胞周期检测点激酶Chk1和细胞周期素依赖性激酶抑制因子p57/kip2是细胞周期中的两个关键调控因子，均可调控细胞周期检测点，参与了肿瘤细胞增殖、修复和凋亡，与肿瘤发生、发展、侵袭转移有关。
　　 目的：Chk1和p57/kip2对人卵巢癌细胞SKOV3及HO8910细胞周期调控的影响及机制研究。
　　 方法：
　　 第一部分：设计合成3段Chk1 siRNA靶向干扰化学片段；分别转染人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910，48h后用RT-PCR方法检测Chk1mRNA表达，Western-blot方法检测Chk1蛋白表达，筛选出能抑制Chk1表达的有效siRNA片段；将筛选出Chk1 siRNA片段转染人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910，48h后用流式细胞术检测转染Chk1 siRNA与未转染Chk1 siRNA细胞SKOV3、HO8910的细胞周期分布情况；用RT-PCR方法和Western-blot方法分别检测细胞周期相关基因CyclinA、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27、Cdc25 AmRNA和蛋白表达。
　　 第二部分：构建p57过表达质粒；转染人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910，48h后用流式细胞术检测转染p57过表达质粒与未转染p57过表达质粒细胞SKOV3、HO8910的细胞周期分布情况；用RT-PCR方法和Western-blot方法分别检测p57及细胞周期相关基因CyclinA、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、p21、p27、Cdc25AmRNA和蛋白表达。
　　 第三部分：用SP免疫组化法检测Chk1和p57/kip2在人浆液性和粘液性卵巢肿瘤组织中的表达。
　　 结果：
　　 第一部分：Chk1 siRNA靶向干扰人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910Chk1表达，可抑制Chk1 G2/M细胞周期检测点阻滞功能；增强细胞周期相关基因CyclinA、CyclinE、CDK2mRNA、Cdc25A和蛋白表达，减弱p21、p27mRNA和蛋白表达，而对CyclinD1、CDK4mRNA和蛋白表达无影响。
　　 第二部分：p57过表达质粒转染人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910增加p57表达，可增强p57G1/S细胞周期检测点阻滞功能；抑制细胞周期相关基因CyclinA、CyclinD1、CyclinE、CDK2mRNA和蛋白表达，而对CDK4、p21、p27、Cdc25AmRNA和蛋白表达无影响。
　　 第三部分：在人恶性上皮性卵巢肿瘤组织中Chk1阳性表达率为89.13％(41/46)，明显低于交界性上皮性肿瘤(P<0.05)；p57在人恶性上皮性卵巢肿瘤组织中阳性表达率为36.96％(17/46)；明显高于恶性上皮性肿瘤(P<0.05)。
　　 结论：
　　 1.Chk1对人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910G2/M细胞周期检测点有阻滞作用，靶向抑制Chk1可上调下游基因CyclinA、CyclinE、CDK2、Cdc25AmRNA和蛋白表达，下调下游基因p21、p27mRNA和蛋白表达。
　　 2.p57对人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910G1/S细胞周期检测点具有阻滞作用，p57过表达可抑制下游基因CyclinA、CyclinD1、CyclinE、CDK2 mRNA和蛋白表达。
　　 3.在人上皮性卵巢肿瘤组织中，Chk1在恶性上皮性肿瘤组织中表达明显高于良性和交界性肿瘤，p57在恶性上皮性肿瘤组织中表达明显低于良性和交界性肿瘤。