Th17细胞与Treg细胞在聚乙二醇干扰素治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎过程中的作用研究

摘要

HBV感染是世界范围内重大的健康问题之一，部分的乙肝病毒感染者最终发展为肝硬化或肝癌。前期的研究认为在慢性乙型肝炎的发展过程中细胞免疫发挥了重要作用，尤其是HBV特异性的CD4+T以及CD8+T细胞在对HBV感染的控制中起至关重要的作用。随着免疫学研究的进展，越来越多的免疫细胞被发现，它们通过复杂的机制，在慢性乙型肝炎的发生发展及临床转归过程中发挥着重要作用。Th17和Treg细胞是两种新发现的CD4+T细胞亚群，在功能上分别为促进和抑制免疫应答，研究发现在正常情况下两种细胞处于一种免疫平衡状态，但我们前期的研究结果显示在慢性乙型肝炎患者体内这种平衡被打破。本实验旨在探索聚乙二醇干扰素治疗慢性乙肝的过程中，T辅助细胞(Th1、Th2、Th17和Treg细胞)的变化特征以及在抗病毒治疗过程中的动态变化规律，并分析Th17/Treg细胞免疫平衡在HBV持续感染的过程中所发挥的作用。
　　方法：
　　选取未经抗HBV治疗的HBeAg+慢性乙型肝炎患者11例，按常规剂量和方法给予聚乙二醇干扰素抗病毒治疗48w，收集患者在基线、治疗4、8、12、24、32、40、48周时的外周血，采用流式抗体进行细胞膜表面和胞内染色技术，运用流式细胞仪对其单个核细胞(PBMC)中Th1、Th2、Th17、Treg等细胞的表达水平进行动态检测，同时在每个治疗时间点检测受试者的相关临床指标(ALT，HBV-DNA，TB及乙肝表面标志物等)，分析在抗病毒治疗过程中各细胞的变化趋势，并观察相互之间是否具有相关性，及与HBV-DNA定量和ALT水平之间是否具有相关性。同时选取健康志愿者20例作为对照组。
　　结果：
　　1.干扰素治疗过程各时间点外周血Th17、Treg、Th1、Th2细胞的变化趋势：在治疗前8周，Th17细胞呈上升趋势，在8周至40周期间呈现为折线形波动，至48周时又出现缓慢升高。Treg细胞则于前4周快速升高，4周到8周时又迅速下降，前8周内以第4周为分界出现倒”V”形变化，随后呈缓慢波动，无明显升降趋势。在治疗过程中，Th17细胞在4周、8周、48周时的表达频率与基线相比差异有统计学意义(p<0.05)，其中24周时的表达频率较基线相比差异更为明显(p<0.01)。Treg细胞仅治疗4周时的表达频率与基线相比差异有统计学意义(p<0.05)。在干扰素治疗前4周，Th1细胞呈快速下降趋势，治疗4-24周期间，其表达出现缓慢波动，24周后又呈现出明显升高趋势，至40周后则快速下降，Th2细胞在治疗过程中表现为水平状波动趋势，无明显变化。在治疗过程中，Th1细胞在4周、8周、12周、24周、48周时的表达频率与基线相比有明显统计学差异(p<0.001)，治疗32周、40周时的表达频率较基线相比差异有统计学意义(p<0.05)。Th2细胞在治疗8周、24周、40周时的表达频率与基线相比差异有统计学意义(p<0.05)。统计结果显示，Th17细胞在CHB患者中的表达频率明显高于健康对照组(p<0.05)，Th2细胞在CHB组中的表达明显高于HC组(p<0.05)。CHB组中的Th17/Treg比率与HC组相比明显升高(p<0.01)，Th1/Th2细胞比率与HC组相比降低(p<0.05)。
　　2.以治疗48周时HBeAg下降至1COI为界分为eAg阳性组(>1COI)和eAg转换组(<1COI)，分析eAg血清学转换患者及eAg阳性患者外周血各细胞比例的差异：在干扰素治疗前4周，两组中的Th1细胞均呈现明显下降趋势，在治疗4周到40周期间表现为波动状上升趋势，至治疗48周时，两组中Th1细胞的表达又迅速降低，整体表现为下降趋势，两组没有明显差别(p<0.05)。在治疗前8周，eAg转换组中。Th2细胞呈明显上升趋势，之后出现缓慢波动，至治疗40周后明显下降，eAg阳性组则始终表现为水平波动趋势，至治疗40周后，也表现为明显下降。在治疗前8周，两组中Th17细胞均表现为明显上升趋势，之后eAg阳性组继续出现上升趋势，至治疗24周后明显下降，eAg转换组则始终呈水平波动趋势，两组在治疗48周时Th17细胞的比例达到相似水平。在治疗前4周，两组中Treg细胞呈明显上升趋势，之后两组均呈现波动状下降趋势。
　　3.在peg-IFN治疗过程中外周血中各细胞比例与HBV-DNA、ALT的相关性分析：经Pearson correlation统计分析，结果显示Th1与Treg细胞比例在基线时表现为显著正相关性(p<0.001)，TH2与TH17细胞在基线时也表现为正相关(p<0.05)，在治疗过程中Th17与Treg细胞、Th1与Th2细胞的变化均呈相反趋势，Th17细胞与Treg细胞在治疗24周、32周时呈负相关性(p<0.05)，Th1细胞与Th2细胞在治疗24周时表现为负相关(p<0.05)。在治疗12周及24周时，Th17/Treg比例与HBV-DNA之间呈负相关(p<0.05)，Th1/Th2比例与HBV-DNA之间无明显相关性，Th1细胞与Th17细胞在治疗12周时均与HBV-DNA定量间存在正相关性(p<0.05)。
　　结论：
　　在慢性乙型肝炎患者体内，Th17细胞处于功能活跃状态，而Treg细胞处于功能抑制状态，这一平衡紊乱在一定程度上与病情严重程度相关。在聚乙二醇干扰素抗病毒治疗的过程中，Th17与Treg细胞、Th1与Th2细胞的变化均呈相反趋势，统计结果显示在治疗12周和24周时Th17/Treg比值与HBV-DNA载量呈负相关，故我们推测这一比率的变化在治疗过程中与乙肝病毒载量下降有关，Th17/Treg不平衡在乙肝病毒持续存在的过程中扮演了重要角色。