肺炎链球菌溶血素诱导THP-1细胞凋亡涉及p38MAPK信号通路的激活

摘要

目的：
　　肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是临床常见的能够引起肺炎、脑膜炎、中耳炎和败血症的革兰阳性菌。在发展中国家肺炎链球菌性败血症致死占5岁以下儿童可预防性死亡的25％，每年导致120多万婴儿死亡。肺炎链球菌的溶血素(Pneumolysin，PLY)在细菌致病和诱导宿主防御应答中发挥重要作用，但是目前对宿主防御肺炎链球菌溶血素的分子机制尚不十分清楚。
　　细菌入血后，血液中的免疫细胞会与细菌及产物发生直接作用或者与感染组织分泌的信号分子发生间接的相互作用，从而引发宿主免疫防御。在这一过程中，单核细胞在机体的免疫防御中发挥了重要作用。但是目前关于单核细胞与PLY相互作用机制的研究少有报道，所以本文采用人急性单核细胞白血病单核细胞株(human acute monocyticleukemia cell line，THP-1)与PLY在体外共孵育的方式来初步探讨单核细胞与PLY相互作用的机制，研究单核细胞凋亡情况及凋亡通路信号分子的变化情况，为进一步研究PLY触发宿主瞬时和早期固有免疫
　　方法：
　　1.采用下述实验方法研究PLY对THP-1细胞生长状态的影响：MTT法测定PLY对THP-1细胞的增殖抑制情况；瑞氏染色观察PLY对THP-1细胞形态的影响；透射电子显微镜观察PLY诱导THP-1细胞亚细胞结构改变情况；流式细胞术检测细胞凋亡率；琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA片段化现象；同时将△A146 PLY(PLY的第146位氨基酸发生缺失突变，无溶血活性)处理组作为阴性对照。
　　2.从以下几方面初步探讨PLY诱导THP-1细胞凋亡的免疫机制：分光光度法测定Caspase3，8，9活性；免疫细胞化学方法测定凋亡相关蛋白Bax、Bcl-Xl及信号分子p38MAPK蛋白表达的变化；通过Western-Blot进一步验证p38MAPK总蛋白表达水平及其磷酸化水平变化；p38MAPK抑制剂处理后通过流式细胞术测定THP-1细胞凋亡率变化情况；同时将△A146 PLY处理组作为阴性对照。
　　结果：
　　1.将THP-1细胞分别与0.05、0.1、0.5、1、2.5、5μg/ml PLY共同孵育24、48、72、96h后，采用MTT法测定细胞增殖抑制情况，结果表明PLY对THP-1细胞生长具有明显的增殖抑制作用，并呈剂量和时间依赖性；0.05μg/ml和0.1μg/ml PLY分别处理THP-1细胞12 h后，通过瑞氏染色观察到细胞发生明显的凋亡形态学改变，透射电子显微镜观察到THP-1细胞发生凋亡，并且出现凋亡小体和核碎裂象等典型凋亡形态特征；0.05μg/ml PLY和0.1μg/ml PLY作用THP-1细胞6h后通过AnnexinV-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率分别为13.15％和24.58％，作用12h后细胞凋亡率分别为17.09％和60.08％(P<0.05)；提取凋亡THP-1细胞DNA，进行琼脂糖凝胶电泳可见典型的凋亡“梯状”条带。
　　2.PLY与THP-1细胞共同孵育后，Caspase3，8，9活性明显升高；免疫细胞化学检测促凋亡蛋白Bax表达水平增高、抗凋亡蛋白Bcl-xl表达水平降低；Western-Blot显示p38MAPK磷酸化水平增高；采用p38MAPK的特异性抑制剂SB203580预处理THP-1细胞后，PLY诱导的THP-1细胞凋亡水平下降。
　　结论：
　　1.肺炎链球菌溶血素与THP-1细胞相互作用致THP-1细胞发生凋亡。
　　2.肺炎链球菌溶血素诱导THP-1细胞凋亡通过线粒体途径，以依赖Caspase的方式，涉及p38MAPK信号通路的激活。