靶向P-选择素载基因和穿膜肽超声造影剂的制备及实验研究

摘要

第一部分：靶向P-选择素载基因和穿膜肽超声造影剂的制备及特性研究
　　目的：制备靶向P-选择素的载基因和穿膜肽超声造影剂，并进行特性研究。
　　方法：以带羧基的磷脂为成膜材料，采用机械振动法制备包载基因和穿膜肽的超声造影剂，再通过碳二亚胺共价连接法与P-选择素抗体连接制备靶向P-选择素的载基因和穿膜肽超声造影剂。检测该靶向超声造影剂的一般物理特性；琼脂糖凝胶电泳检测载基因和穿膜肽超声造影剂对DNA的结合力和保护作用；采用激光共聚焦显微镜观察基因和穿膜肽在超声造影剂中的分布情况；荧光分光光度法检测超声造影剂中基因和穿膜肽的包封率；通过免疫荧光法验证造影剂与抗体的连接情况。
　　结果：制备的靶向P-选择素载基因和穿膜肽超声造影剂的平均粒径约为(2.15±0.36)μm。光镜下观察其形态规则，呈圆球形，大小分布均匀，无明显粘连聚集现象，外观与非靶向组超声造影剂比较无明显差异。琼脂糖凝胶电泳显示载基因和穿膜肽超声造影剂与DNA有较强的结合力，并能保护其不被核酸酶水解。激光共聚焦显微镜下观察，基因和穿膜肽均分布在超声造影剂的外壳上。超声造影剂中基因和穿膜肽的包封率分别为28％和25％。通过免疫荧光法在倒置荧光显微镜下观察到靶向超声造影剂外壳呈现红色荧光。
　　结论：成功制备了靶向P-选择素的载基因和穿膜肽超声造影剂。
　　第二部分：靶向P-选择素载基因和穿膜肽超声造影剂促基因转染初步实验研究
　　目的：探讨靶向P-选择素的载基因和穿膜肽超声造影剂促进基因转染缺氧损伤型人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的可行性。
　　方法：采用过氧化氢诱导HUVEC表达P-选择素制备细胞缺氧损伤模型。光镜下观察制备的靶向P-选择素载基因和穿膜肽超声造影剂与缺氧损伤的HUVEC的特异性结合情况，流式细胞仪检测特异性结合率。将缺氧HUVEC随机分为靶向载基因和穿膜肽超声造影剂组和非靶向载基因和穿膜肽超声造影剂组进行转染实验，转染24h后倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在HUVEC中的表达情况，并采用流式细胞仪检测转染率。
　　结果：体外特异性结合实验显示，光镜下靶向超声造影剂组见造影剂结合在缺氧损伤的HUVEC周围，而非靶向超声造影剂组仅见极少量造影剂与细胞结合。流式细胞仪检测靶向超声造影剂组大约有73.80％的细胞表面结合有造影剂，而非靶向超声造影剂组仅有1.39％的细胞表面结合有造影剂。转染24h后，倒置荧光显微镜下观察到靶向组和非靶向组均有绿色荧光蛋白在HUVEC中表达，流式细胞仪检测结果显示靶向组的转染率高于非靶向组[(18.74±0.47)％vs(15.34±0.22)％]，差异有统计学意义(t=10.923，P<0.001)。
　　结论：靶向P-选择素载基因和穿膜肽超声造影剂能够与缺氧损伤型HUVEC发生特异性结合，并促进基因在缺氧损伤型HUVEC中表达，这为靶向基因传递提供了新的思路。