ATRA对缺糖缺氧损伤PC12细胞的抗凋亡作用及机制探索

摘要

第一部分ATRA对缺糖缺氧损伤PC12细胞的抗凋亡作用初探
　　背景：维生素A缺乏(Vitamin A deficiency，VAD)、铁缺乏、碘缺乏已被WHO和联合国儿童基金会确定为世界三大营养素缺乏性疾病。WHD在世界范围内普遍存在，其中孕妇和儿童是其高危人群。新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是新生儿期常见的中枢神经系统高发病、危重病，是导致新生儿死亡和残疾的主要原因之一。有研究表明，HIBD的主要发病机制包括脑血流动力学变化、脑细胞能量代谢衰竭、再灌注损伤与氧自由基的产生、钙内流、兴奋性氨基酸导致神经毒性作用、迟发性神经元死亡和凋亡，其中细胞凋亡是HIBD神经细胞死亡的主要形式。本课题组的前期研究发现，HIBD新生大鼠体内VA水平与其神经功能的修复存在密切的相关性，但其具体分子机制目前还不清楚。
　　目的：体外探讨全反式视黄酸(ATRA)对缺氧缺糖损伤(OGD)后的PC12细胞的修复作用。
　　方法：建立PC12细胞OGD损伤模型，给予不同ATRA浓度(0.5、2、4和20μmol/L)诱导，利用Annexin V-PI流式细胞术检测PC12细胞的凋亡发生率，荧光探针JC-1测定细胞线粒体膜电位的变化，同时运用Real-time PCR技术和Western blot技术分析ATRA对OGD损伤后的PC12细胞线粒体凋亡通路关键性凋亡因子表达水平的影响。
　　结果：光镜下观察显示PC12细胞OGD损伤后，细胞聚团生长，胞体皱缩，折光性下降；Annexin V-PI、JC-1检测显示细胞凋亡率明显增加，线粒体膜电位下降明显；加入2、4μmol/L ATRA后均可降低细胞凋亡率，并保持线粒体膜电位的相对稳定，尤以4μmol/LATRA作用效果明显；与对照组相比较，0.5μmol/L ATRA组没有显著差异；但20μmol/L ATRA组的细胞凋亡率及线粒体膜电位下降率增高。Real-time PCR和Western blot检测显示，4μmol/L ATRA组较OGD损伤组中的促凋亡因子Bax的表达水平显著下调，抗凋亡因子Bc1-2明显升高，蛋白表达水平与mRNA水平变化一致。
　　结论：4μmol/L ATRA对OGD损伤后的PC12细胞具有抑制凋亡的作用，其机制可能是ATRA通过上调Bc1-2和下调Bax的表达，影响线粒体凋亡通路，从而实现对缺糖缺氧损伤细胞的保护作用。
　　第二部分RARα调节缺糖缺氧损伤PC12细胞抗凋亡作用
　　背景：HIBD后神经元的死亡形式主要为细胞凋亡，位于线粒体的Bc1-2家族及其编码的蛋白质表达失衡是线粒体凋亡通路中的关键事件，最终导致细胞结构和功能的广泛损害。本课题组前期的研究表明，体内正常VA水平更有效地促进HIBD大鼠的神经细胞的功能恢复，其机制可能是由于VAD抑制了RARα的表达，降低了神经细胞Ca2+的兴奋性，从而影响学习记忆能力。我们前一部分研究结果显示，4μmol/LATRA能够通过调节线粒体凋亡通路，抑制神经细胞的凋亡，其机制是否是通过RARα的调节而发挥作用，将作进一步研究。
　　目的：探讨RA信号通路中RARα在缺糖缺氧损伤的PC12细胞抗凋亡的调节作用。
　　方法：采用本课题组自行构建的视黄酸核受体siRARα重组腺病毒(Ad-siRARα)感染PC12细胞，应用RT-PCR方法检测Ad-siRARα对RARα受体的抑制效率。利用Ad-siRARα技术，进一步观察4μmol/LATRA对损伤的PC12细胞抗凋亡的影响，同时以空腺病毒载体为对照。Annexin V-PI和荧光探针JC-1染色，流式细胞技术分别检测sirARα感染PC12细胞后细胞凋亡率及线粒体膜电位下降率的变化，进一步运用Real-time PCR和Western blot技术分析RARα受体与线粒体凋亡通路中关键因子基因和蛋白表达水平的变化。
　　结果：PC12细胞缺糖缺氧损伤后，RARGα mRNA表达水平降低。Ad-siRARα感染36h后，可有效抑制RARα基因表达。经Annexin V-PI和荧光探针JC-1染色，流式细胞技术检测显示，4μmol/L ATRA诱导的OGD损伤PC12细胞在Ad-siRARα感染条件下，其细胞凋亡率及线粒体膜电位下降率均明显增高。同时，Real-time PCR和Western blot结果表明，感染Ad-siRARα重组腺病毒的PC12细胞OGD损伤后，Bax表达水平显著增高，Bc1-2的表达降低。
　　结论：重组腺病毒Ad-siRARα显著抑制了ATR-A对OGD损伤的PC12细胞的抗凋亡保护作用，提示ATRA通过调节RA信号通路中的RARα，影响线粒体凋亡信号通路中关键因子Bax和Bc1-2的表达水平，从而发挥对OGD损伤的PC12细胞的保护作用。