超声微泡介导siMDR1转染提高睾丸肿瘤化疗效果的实验研究

摘要

睾丸肿瘤是生殖系统常见肿瘤，临床上恶性睾丸肿瘤化疗效果不佳是影响治疗结果的重要原因。研究发现与肿瘤多药耐药相关的P-糖蛋白在睾丸毛细血管内皮细胞上高表达形成一种生物学屏障，阻止化疗药物的进入，这可能在睾丸肿瘤的耐药中发挥了重要作用。如何突破这道屏障而逆转耐药，就成为睾丸肿瘤治疗中的难点。本课题拟采用基因沉默的方法，用携带MDR1基因特异性小干扰RNA的真核表达质粒pSEB-siMDR1去抑制血管内皮细胞中P-糖蛋白的表达和功能，从而促进化疗药物进入睾丸组织中。但高效定向的体内基因转染是本研究的关键点，超声微泡的应用为实现体内靶向转染siMDR1基因提供了一种可靠的新方法。携带pSEB-siMDR1质粒的微泡，由静脉注入可通过循环到达睾丸，在超声作用下破坏微泡实现siMDR1小干扰RNA体内向睾丸毛细血管内皮细胞的靶向转染，抑制P-糖蛋白表达和功能，为化疗药物进入睾丸内有效杀灭肿瘤提供了条件，从而提高睾丸肿瘤治愈率。基于以上设想，本课题的研究内容包括以下4部分。
　　第一部分携带siMDR1的真核表达质粒构建及功能鉴定
　　目的：构建pSEB-siMDR1真核表达质粒，并通过检验其对内源性MDR1基因及P-糖蛋白表达和功能的抑制效果，筛选出有效的siMDR1序列。
　　方法：设计4对特异性针对大鼠MDR1基因的siRNA序列，退火后分别与pSEB-HUS质粒连接，重组获得pSEB-siMDR1真核表达质粒，PCR、酶切及测序鉴定插入片段。通过脂质体分别将4种pSEB-siMDR1转染到L2RYC细胞，并设置pSEB-HUS空质粒作为对照，以及等量混合共转染组(siMDR1 Pool)。转染48h后提取各组的总RNA和总蛋白，用real-time PCR及Western-blot检测MDR1的mRNA及蛋白表达，并用MTT法检测转染后长春新碱对L2RYC细胞增殖的影响。
　　结果：重组获得的4种pSEB-siMDR1经PCR扩增均可检测到约300bp的条带，pSEB-HUS空质粒对照无此条带；Not I酶切pSEB-HUS对照可获得1321bp和>5000bp条带各一条，重组成功的质粒仅有>6000bp一条带。重组质粒送测序，结果与所设计的siRNA序列完全一致，4种pSEB-siMDR1质粒构建成功。各组转染后均可见绿色荧光表达，siMDR1-1，-2，-3和-4均能不同程度抑制MDR1基因表达，siMDR1 Pool组抑制效率最高，其中siMDR1-1，-2，-3和Pool组与对照组相比有统计学差异(P<0.05)，而siMDR1-4与对照相比无统计学差异(P>0.05)。P-糖蛋白表达与MDR1基因表达情况一致。抑制后，长春新碱使L2RYC细胞的增殖降低，siMDR1 Pool组最明显
　　结论：重组pSEB-siMDR1真核表达质粒构建成功，能有效抑制MDR1基因和蛋白的表达，siMDR1 Pool能最好地抑制MDR1的内源性表达，因此后续实验将选用siMDR1 Pool进行转染。
　　第二部分超声联合微泡体外促pSEB-siMDR1质粒转染逆转肿瘤细胞耐药性
　　第一节超声联合微泡体外细胞转染最适条件筛选
　　目的：探讨超声联合微泡体外转染细胞的主要影响因素，筛选pSEB-siMDR1质粒转染L2RYC细胞的最适条件。
　　方法：机械振荡法制备脂质微泡，然后用PLL吸附法将pSEB-HUS质粒分层包裹在微泡外表面，制成载基因微泡。用不同强度的超声和不同超声暴露时间组合作为转染的条件，台盼蓝染色检验转染后细胞的存活率，流式细胞仪检测质粒的转染效率。
　　结果：不同细胞转染的条件不同，随着超声强度和暴露时间增加，转染效率不断增高，超过一定限度后细胞死亡也明显增加而不能用于后续实验。当超声强度0.5W/cm2以及暴露时间为30s时，能保证90％以上细胞存活且转染效率26％。
　　结论：适合的超声强度和暴露时间能够明显促进质粒转染细胞，并不会对细胞存活产生明显的影响。
　　第二节超声联合微泡促pSEB-siMDR1转染降低细胞对化疗药物耐药
　　目的：研究超声联合载pSEB-siMDR1微泡的体外转染效率以及转染后对MDR1基因及P-糖蛋白表达和功能的抑制。
　　方法：将pSEB-siMDR1质粒或制备的携带pSEB-siMDR1质粒的脂质微泡加入培养的细胞中，设置实验分组：①单纯质粒组(Ⅰ组)②质粒+超声组(Ⅱ组)③载基因微泡组(Ⅲ组)④载基因微泡+超声组(Ⅳ组)⑤空白对照组(Ⅴ组)⑥脂质体对照组(Lipo组)，用超声参数0.5W/cm2、30s进行照射，转染后用流式细胞计数检测GFP阳性细胞率，实时荧光定量PCR及Western-blot检测转染后MDR1 mRNA及P-糖蛋白的表达。最后，用柔红霉素蓄积实验检测细胞膜上P-糖蛋白的功能，MTT法检测长春新碱和更生霉素对细胞增殖的影响。
　　结果：仅Ⅳ组和Lipo组转染后L2RYC细胞内有绿色荧光表达，流式细胞计数定量转染率Ⅳ组31.9％，明显高于其余各组(P<0.05)。Ⅳ组转染后L2RYC细胞的MDR1 mRNA及P-糖蛋白的表达降低，其余各组无明显变化。Ⅳ组柔红霉素在细胞内蓄积高于其余各组(P<0.05)。Ⅳ组长春新碱和更生霉素IC50为1.34μg/ml和0.11μg/ml，明显低于其余各组(P<0.05)。
　　结论：仅在超声与微泡造影剂同时存在的情况下，能显著提高pSEB-siMDR1质粒转染L2RYC细胞的效率，并显著抑制MDR1基因及P-糖蛋白的表达和功能。抑制后，L2RYC细胞对化疗药物的敏感性提高。
　　第三部分超声联合微泡促pSEB-siMDR1体内靶向转染
　　第一节大鼠睾丸肿瘤动物模型的建立
　　目的：以卵黄囊瘤为例，建立睾丸肿瘤大鼠动物模型的制备方法。
　　方法：分别选取3周龄和3月龄的雄性SD大鼠，将培养的L2RYC细胞分别制备成的细胞悬液，无菌操作下将10μl细胞悬液注入右侧睾丸网内。各年龄大鼠分别设3组，接种细胞量为1×106、1×107和1×108，左侧为自身对照，每个处理组10只。术后每周测量睾丸直径，进行B超检查，观察睾丸肿瘤生长情况，并取睾丸行HE染色及免疫组化检查。
　　结果：注入1×108细胞后，无论3周龄或3月龄鼠均在1-2周内睾丸迅速增大破溃，B超见明显内部液化，病理组织检查提示为坏死灶，大鼠短期内衰竭死亡。细胞量为1×107时，3月龄鼠成瘤率仅12.5％，3周龄鼠在接种后肿瘤逐渐发生，3周成瘤率100％，随着肿瘤生长大鼠全身状态恶化，4周开始先后死亡。成瘤鼠的睾丸B超提示为密度均匀稍低的肿块部分有低回声区；HE染色为疏松网状结构，可见嗜酸性小体和S-D小体；免疫组化Cspg4染色阳性。接种细胞量为1×106时，至实验终点未见成瘤。
　　结论：用1×107细胞是制备模型较合适的剂量，细胞过多使睾丸短期内坏死，过少则不能成瘤。制备的大鼠睾丸卵黄囊瘤模型的组织学表现与临床相似，可以用于后续实验。
　　第二节超声联合微泡促pSEB-siMDR1靶向转染睾丸血管内皮
　　目的：探讨应用超声联合微泡介导pSEB-siMDR1转染大鼠睾丸毛细血管内皮的可行性，以及转染后对毛细血管内皮细胞中MDR1基因，P-糖蛋白表达和功能的抑制效果。
　　方法：包载pSEB-siMDR1质粒的脂质微泡由大鼠尾静脉注入，5分钟后在睾丸部位开始连续照射10分钟，设置实验分组：①单纯质粒组(Ⅰ组)②质粒+超声组(Ⅱ组)③载基因微泡组(Ⅲ组)④载基因微泡+超声组(Ⅳ组)⑤空白对照组(Ⅴ组)，冰冻切片用荧光显微镜检测pSEB-siMDR1质粒的转染定植部位，PCR和western blot检测转染后MDR1基因和P-糖蛋白的表达。用荧光显微镜检测不同处理后，柔红霉素在睾丸组织中的存留情况。
　　结果：超声作用后，仅在Ⅳ组的毛细血管壁上可见绿色荧光蛋白的表达，转染后MDR1基因和P-糖蛋白表达明显降低(P<0.05)，柔红霉素的红色荧光在Ⅳ组睾丸组织内蓄积明显多于其余各组。
　　结论：超声联合微泡能促进pSEB-siMDR1对大鼠睾丸毛细血管的转染，抑制P-糖蛋白的表达及其药泵功能，使化疗药物更容易在睾丸组织内积聚。
　　第四部分超声联合微泡靶向转染pSEB-siMDR1提高睾丸肿瘤化疗效果的实验研究
　　目的：探讨应用超声联合微泡转染pSEB-siMDR1到荷瘤鼠睾丸内，能否提高其化疗效果。
　　方法：将建模成功的大鼠分组：①单给化疗药(A组)②微泡+超声+化疗药(B组)③载基因微泡+超声+化疗药(C组)④对照组(D组)；监测肿瘤的生长及荷瘤鼠存活率，给药完后1周处死大鼠，取睾丸组织检测指标：比较各组肿瘤的大小、重量；HE染色后观察肿瘤病理变化；PCR检测凋亡相关基因Fas、P53的表达。
　　结果：加用化疗药物后，C组大鼠肿瘤生长抑制，相对睾丸体积均明显小于其余各组，同一时间点存活率也高于其余各组，肿瘤细胞减少，睾丸部分形态保留；Fas和P53基因表达增加。
　　结论：超声联合微泡靶向转染pSEB-siMDR1能够提高睾丸肿瘤的化疗效果，增加肿瘤细胞的死亡，使荷瘤鼠存活率提高。