重组葡激酶的表达纯化及其纤溶活性的鉴定

摘要

目的：构建葡激酶(staphy lokinase，SAK)基因的原核表达质粒，在大肠杆菌原核表达系统中表达SAK蛋白，检测其蛋白质的表达情况，纯化该蛋白质并初步鉴定其生物学活性，为临床血栓性疾病的治疗提供可能的溶栓新药。
　　方法：基于生物信息学方法，分析优化基因序列，使用基因合成技术合成葡激酶的基因序列，连接表达载体，转化感受态大肠杆菌克隆菌株DH-5α，运用PCR的方法筛选阳性克隆，提取双酶切阳性的质粒，并转化感受态大肠杆菌BL21菌株，使含有葡激酶目的基因的质粒在BL21大量表达目的蛋白-葡激酶，利用离子交换柱(DEAE)，分子筛(superdex 75)等进行分离纯化，并用紫外核酸蛋白仪检测目的蛋白的浓度，应用纤维蛋白平板溶圈法测定并评价其溶栓生物活性。
　　结果：葡激酶在大肠杆菌中以可溶上清的方式高效表达，利用离子交换柱和分子筛等纯化效果良好，纯度达95％，以紫外核酸蛋白仪测蛋白浓度为2.05 mg/mL。体外实验显示其纤溶活性与尿激酶标准品相当。
　　结论：
　　(1)应用全基因合成经过优化的SAK基因可在原核表达体系(大肠杆菌系统)中高效的以可溶性上清的方式高效表达。
　　(2)以基因合成技术合成的SAK基因所表达的葡激酶具有与尿激酶标准品相当的纤溶活性。