人三碘甲腺原氨酸抗体的制备和检测方法的建立及其方法学评价

摘要

游离三碘甲腺原氨酸(free3，5，3’-triiodothyronine，FT3)是甲状腺激素之一，因浓度不受结合蛋白的影响，可以直接反应甲状腺功能，检测人血清中的FT3是诊断甲状腺功能亢进的直接指标。但是目前，临床检测FT3仍依赖于进口仪器和试剂，价格昂贵，制约了其应用范围。
　　目的：
　　制备T3完全抗原，将其免疫大白兔，制备抗人T3多克隆抗体，应用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)系统开发新型非均衡竞争技术，建立一种能广泛应用于临床检测FT3的方法，并进行方法学评价；用制备的T3完全抗原免疫Balb/c小鼠，制备T3单克隆抗体，为进一步建立人血清T3检测方法以及研究T3的生物学作用提供基础。
　　方法：
　　1、应用碳二亚胺法将T3纯品分别与牛血清白蛋白、牛血清γ球蛋白偶联，制备完全抗原。
　　2、以T3-牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)为抗原免疫新西兰大白兔，制备抗人T3多克隆抗体。
　　3、用辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标记自制的抗人T3多克隆抗体，用FITC标记T3类似物-BGG。采用抗FITC抗体包被发光板，FITC-BGG-T3类似物与抗FITC抗体结合形成固相抗原，通过非均衡竞争法原理，固相抗原与血清中FT3竞争结合抗T3抗体-HRP，通过标准曲线计算FT3浓度，建立方法学评价并与直接用T3-牛血清γ球蛋白(Bovine serum gamma globulin，BGG)包被(非FITC系统)的检测系统相比较。将本方法应用于临床120份血清标本的检测，定量结果与Roche2010电化学发光全自动免疫分析系统(Elecsys2010)定量结果进行比较。
　　4、以T3-牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)为抗原免疫Balb/c小鼠，以50％的聚乙二醇为融合剂将免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经克隆化、有限稀释筛选，建立能稳定表达抗T3的杂交瘤细胞株，并通过小鼠体内诱生法制备大量的单克隆抗体。纯化制备的单克隆抗体，并从纯度、效价、亚型等方面对其进行鉴定。
　　结果：
　　1、抗体经酶联免疫吸附实验证明对T3具有高度特异性。
　　2、应用FITC系统建立的非均衡竞争化学发光免疫分析标准曲线的线性R>0.99，线性范围0.25～50 pg/mL，分析灵敏度为0.25 pg/mL，精密度测试批内、批间变异系数CV<5％，检测结果优于非FITC系统的检测。对于临床血清标本的检测，其定量结果与Roche Elecsys2010定量试剂盒的定量结果具有很好的相关性，相关系数R=0.9622，两者的测定值无显著性差异(P>0.05)。
　　3、应用杂交瘤技术，建立了2株能稳定分泌抗T3单克隆抗体的细胞株，将其中一株细胞株注射入小鼠腹腔，制备了富含抗T3单克隆抗体腹水。纯化后抗体的效价为1:32000，属于IgG1型。
　　结论：
　　1、应用偶联技术成功制备了T3完全抗原，并以此为免疫原制备了兔抗人T3多克隆抗体，及鼠抗人T3单克隆抗体。
　　2、以FITC系统为平台建立的非均衡竞争FT3检测化学发光法具有精密性好、灵敏度高、稳定性强，有良好的准确性，达到临床测定的需求。