人胱抑素C抗体制备和检测方法建立及其方法学评价

摘要

胱抑素 C (cystatin C，Cys C)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白，其血清浓度测定是优于传统的血尿素、尿酸、肌酐和内生肌酐清除率测定的新的肾功能评价指标。2002年FDA网上公布了26个在检验医学有重大突破的全新检测项目，血清 (浆)Cys C测定便是其中之一。但目前临床试验室测定Cys C均为需要昂贵特殊仪器和试剂盒的方法，制约了其推广应用。 目的： 构建人Cys C的原核表达载体，将纯化的Cys C重组蛋白免疫大白兔，制备Cys C抗血清，为建立Cys C的检测方法奠定基础；用自制的Cys C抗血清，建立可在自动生化分析仪上定量测定血清Cys C的颗粒增强透射免疫分析法(particle enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)，并进行方法学评价，为该法的临床应用奠定基础；用纯化的重组Cys C蛋白免疫Balb/c小鼠，制备Cys C单克隆抗体，为进一步建立Cys C其他免疫学测定方法，以及研究Cys C的其他生物学作用和机制提供基础。 方法： 1．采用RT-PCR技术，从细胞中扩增Cys C目的基因，并将其克隆到 pET32a(+)原核表达载体，构建重组 Cys C 原核表达质粒pET32a(+)/Cys C。 2．将构建的重组表达质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，诱导重组蛋白表达，表达蛋白经镍离子亲和层析系统纯化，并进行鉴定。 3．用纯化重组蛋白免疫大白兔，制备Cys C抗血清。 4．采用自制提纯的Cys C抗血清包被乳胶颗粒，建立可在自动生化分析仪上定量测定Cys C的PETIA，并将此法与进口商品化试剂盒进行比对实验，以及进行准确度、精密度、线性范围、检测限、干扰试验等方法学评价试验。 5．用纯化重组的Cys C蛋白免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经过克隆化和筛选，建立稳定分泌抗Cys C的杂交瘤细胞株，并通过动物体内诱生腹水大量制备单克隆抗体。 结果： 1．经基因克隆及重组技术，获得了35 kD的Cys C融合蛋白，其表达形式为不溶性包涵体，此包涵体蛋白经Ni<'2+>亲和层析能有效纯化；以该蛋白免疫大白兔制备了Cys C抗血清。 2．采用自制提纯的Cys C抗血清包被乳胶颗粒，建立了可在自动生化分析仪上定量测定Cys C的PETIA，方法学评价实验显示该法具有较好的检测性能指标，并与进口的商品试剂盒有很好的可比性，符合临床应用要求。 3．采用杂交瘤技术，建立了稳定分泌抗Cys C单克隆抗体的 2 株杂交瘤细胞株，将其中 1 株细胞注射于小鼠腹腔，得到了富含Cys C单克隆抗体的小鼠腹水。 结论： 1．经基因重组技术获得了35 kD的Cys C融合蛋白，利用此蛋白抗原制备得到兔抗人Cys C抗血清(多克隆抗体)，并成功制备了鼠抗人Cys C单克隆抗体。 2．采用自制的Cys C抗血清，建立了在自动生化分析仪上定量测定Cys C的PETIA，该法具有较好的性能指标，与商品化进口试剂盒有很好的可比性，符合临床应用要求。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前言

第一部分人胱抑素C的原核表达、纯化、鉴定及抗血清的制备

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分颗粒增强透射免疫分析法测定血清胱抑素C方法学建立及评价

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第三部分人胱抑素C单克隆抗体制备及初步鉴定

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

综述一人血清胱抑素C测定的临床应用进展

综述二杂交瘤技术制备单克隆抗体的实验技术进展

致谢

攻读学位期间撰写、发表的学术论文及获得的科研基金资助情况