产肠毒素大肠杆菌987P菌毛FasA亚单位的原核表达、纯化及免疫原性分析

摘要

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia Coli，ETEC)是引发仔猪、牛犊、羔羊等农场家畜(禽)水样腹泻的最主要致病菌之一，其高发病率和致死率给畜牧养殖业造成很大经济损失[1]。ETEC的致病机理与其两种保护性抗原密切相关：肠毒素(enterotoxins)和粘附素(adhesins)，肠毒素有耐热型(heat-stable)和不耐热型(heat-labile)两种，粘附素，也称为菌毛(pili)，介导ETEC粘附于家畜小肠粘膜上皮细胞微绒毛上，菌毛有多种血清型，最常见的有K88、K99、987P、F41等，而987P+ETEC是仔猪腹泻的主要病原菌之一。
　　本研究将987P+ETEC菌毛FasA亚单位的基因fasA构建到原核表达载体上，表达FasA亚单位，经亲和层析获得纯化的FasA亚单位，免疫小鼠，分析其免疫原性，为研制以双歧杆菌为表达载体的新型ETEC细菌载体活疫苗做基础研究。
　　第一部分：PCR扩增987P+ETEC的fasA基因，连接到原核表达载体pQE-30上，构建重组原核表达载体pQE-30-fasA，转化大肠杆菌表达菌E.coliM15，IPTG诱导表达FasA亚单位，SDS-PAG电泳确定蛋白的表达形式、条件和效率。用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒分离纯化蛋白，透析复性浓缩后，于-70℃冰箱保存。
　　第二部分：用纯化后的FasA亚单位免疫BALB/c小鼠，制备抗FasA的抗血清，用ELISA法检测抗血清效价，分析FasA亚单位免疫原性。
　　本研究成功构建了FasA亚单位的重组表达载体pQE-30-fasA，经IPTG诱导，FasA亚单位获得高效表达。免疫BMLB/c小鼠所制备的抗血清效价为1:125000，表明FasA亚单位对小鼠有很好的免疫原性为进一步研制以双歧杆菌为表达系统的新型ETEC细菌载体活疫苗奠定了基础。