超声破坏微泡介导内皮抑素基因治疗肝癌及其机制研究

摘要

第一部分:携内皮抑素脂质基因超声微泡的制备
　　第一节:重组人内皮抑素质粒载体的构建、纯化及鉴定
　　目的:构建重组人内皮抑素真核表达载体并制备脂质超声微泡携带目的基因。方法:根据目的基因片段设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增并纯化，然后将纯化的目的基因与pEZ-M46载体分别酶切并进行连接，构建内皮抑素基因重组真核表达载体pEZ-M46-ES，并转化至大肠肝菌，进行菌落PCR、酶切分析和DNA测序鉴定重组克隆。结果:经双酶切电泳和DNA测序分析证实，重组克隆载体内的目的基因片段序列与GENEBANK上报道的Endostatin基因序列基本一致，编码蛋白质的氨基酸序列完全相同。结论:成功构建了人重组内皮抑素基因质粒载体。
　　第二节:微泡基因载体的制备及基本特性检测
　　目的:研制性能稳定、高效的微泡类基因载体以携带目的基因。方法;采用成膜水化法、膜挤压法和机械振荡法分别制备脂质超声微泡和纳米脂质体，通过生物素-亲和素法将微泡-纳米脂质体连接起来，以构建载基因量高的微泡类载体；在配方中加入带正电荷的成膜材料DC-胆固醇(DC-cholesterol)，通过机械振荡法制备阳离子脂质超声微泡，光镜下观察微泡形态，并对其体外基本特性(浓度、粒径、表面电荷)、增强超声显像效果、载基因特性等进行考察。结果光镜下显示，纳米脂质体被成功连接到了脂质微泡表面，然而其连接效率差，浓度过低；成功制备了阳离子脂质超声微泡，微泡表面形态规整，大小均一，分散度好，其浓度、粒径及表面电荷分别为3.13±0.26×109/ml，1.6+0.29μm，21.07±5.30 mV。在造影模式下，能显著增强兔肝脏超声显像，持续时间长。普通微泡带负电荷或不带电荷，携带基因能力低，而阳离子微泡携带较多正电荷，载基因量显著增加。两者的基因结合率分别为4.33±1.47％和31.45±5.16％。结论纳米脂质体-超声微泡复合物不符合超声造影剂要求，无法作为基因载体携带目的基因联合超声进行下一步的靶向治疗研究；阳离子脂质超声微泡具备超声造影剂的基本特性，并可成为一种高效的基因载体。
　　第二部分:超声破坏阳离子微泡介导内皮抑素基因体外细胞转染实验
　　第一节:超声破坏微泡介导内皮抑素基因转染对脐静脉内皮细胞生长和血管形成的影响
　　目的:探索超声破坏微泡介导基因治疗的最佳声学条件，然后以阳离子微泡作为基因载体，联合超声介导内皮抑素基因转染脐静脉内皮细胞(HUVEC)，研究其对细胞生长和血管形成的抑制作用。方法:将pEZ-M46-ES质粒转化大肠杆菌，采用质粒抽提试剂盒扩增纯化质粒，调整质粒浓度为0.1μg/μl进行转染。收集对数生长期人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，首先采用不同强度超声进行分组处理，分别为：0.1、0.2、0.3、0.5 W/cm2，然后将超声强度固定为0.1 W/cm2，加入不同浓度微泡后联合处理，微泡浓度分别为：1、3、5、7×108/ml，根据细胞存活情况筛选出最佳超声强度和微泡浓度组合，然后按以下分组对细胞进行处理：①空白对照组(C)，②质粒+脂质体组(P+L)，③质粒+超声辐照组(P+US)，④质粒+阳离子微泡组(P+US)，⑤质粒+阳离子微泡+超声辐照组(P+MB++US)。①组以空质粒作为阴性对照，②组以脂质体2000介导基因转染作为阳性对照，③组观察单独超声基因转染的影响，④组观察单独阳离子微泡介导基因转染的效果，⑤组测试超声破坏阳离子微泡介导内皮抑素基因转染的效果。对各组细胞进行处理后24h，(1)在倒置荧光显微镜下观察转染情况，并收集细胞采用流式细胞术检测转染效率；以MTT法观察各组细胞生长情况，计算抑制率；(2)Western blot法检测各组细胞中Endostatin的表达情况。(3)将HUVEC细胞接种至预先铺好Matrigel的Ttranswell中，建立体外人造微血管模型，同上进行分组处理，24 h后进行固定、染色，观察血管网的形成数量。结果超声强度为0.1和0.2W/cm2时，细胞存活率未受明显影响，达到0.3W/cm2时，细胞存活率出现一定程度降低，达到0.5W/cm2时，细胞存活率急剧下降。超声强度固定为0.1 W/cm2，微泡浓度为7×108/ml时，细胞存活率轻度降低。分组转染pEZ-M46－ES质粒后，倒置荧光显微镜下可观察P+MB+US组和P+L组均有大量细胞发出绿色荧光，P+US组和P+MB组仅少数细胞表达荧光，流式细胞术检测转染率各实验组分别为：31.24±8.3％，12.57±0.67％，3.14±0.72％，30.64±8.5％。MTT检测结果发现P+MB+US组和P+L组HUVEC细胞移抑制率显著高于其他各组，但两组间差异无显著性，与对照组比较，各实验组细胞生长抑制率分别为：33.47±0.67％，15.49±2.56％，3.23±1.97％，35.52±8.67％；转染pEZ-M46-ES质粒后，western blot法可检测到转染内皮抑素基因后细胞内Endostatin的表达。各组HUVEC细胞形成网状血管结构数量分别为28.47±3.52，9.17±1.62，22.19±4.33，25.26±5.31，4.42±1.52。结论:最佳超声强度与微泡浓度组合为0.1 W/cm2+7×108/ml，转染质粒后，与质粒+超声或单独阳离子微泡相比，超声破坏微泡能显著增强内皮抑素基因转染脐静脉内皮细胞的效率，提高其表达水平，但与脂质体相比，差异无显著性。转染内皮抑素基因能够明显抑制脐静脉内皮细胞的生长，并能抑制HUVEC细胞网状血管结构的形成。
　　第二节:超声破坏微泡介导内皮抑素基因转染对HepG2细胞侵袭和转移特性的影响
　　目的:以阳离子微泡作为基因载体，通过超声破坏微泡作用介导内皮抑素基因转染肝癌HepG2细胞，研究内皮抑素对HepG2细胞迁移、侵袭、克隆形成及诱导血管形成能力的影响。方法:常规培养人肝癌HepG2细胞，按以下分组进行转染pEZ－M46-ES质粒：①空白对照组(C)，②质粒+超声辐照组(P+US)，③质粒+阳离子微泡组(P+MB)，④质粒+阳离子微泡+超声辐照组(P+MB++US)。处理后通过化痕法、Transwell系统和Matrigel人工基底膜检测细胞迁移、侵袭情况；通过软琼脂集落实验(Soft agar)观察各组HepG2细胞增殖形成克隆的能力；将HepG2细胞转染内皮抑素基因后与HUVEC细胞共培养于Transwell系统，观察HUVEC细胞血管网形成情况，并以ELISA法检测HepG2细胞培养上清中VEGF的表达情况。结果: HepG2细胞转染pEZ-M46－ES质粒，P+MB++US组穿过聚碳酸酯膜的细胞数量和细胞克隆形成的数量明显少于其他组，与HUVEC细胞共培养时，诱导血管形成的数量也低于其他组。P+US组和P+MB组细胞转染效率较低，与对照组相比，P+US组迁移、侵袭细胞和形成克隆数量有一定减少，诱导HUVEC形成血管数量少于对照组，但P+MB组与对照组相比未见明显改变。ELISA结果显示，经P+MB++US处理后细胞培养上清中VEGF表达水平最低。结论:超声破坏微泡介导内皮抑素基因转染对HepG2细胞迁移、侵袭、克隆形成及诱导血管形成能力具有明显的抑制作用。
　　第三部分:超声破坏微泡介导内皮抑素基因对肝癌H22移植瘤生长的影响
　　目的:研究超声破坏微泡介导内皮抑素基因转染对肝癌H22移植瘤生长的抑制作用及相关机制。方法:(1)将pEZ－M46－ES质粒与阳离子微泡进行孵育，得到载内皮抑素基因微泡。常规悬浮培养小鼠H22细胞，离心收集处于对数生长期细胞，调整细胞浓度，以5.3×107/ml接种至昆明小鼠背部皮下，每只小鼠注射0.2ml肿瘤细胞悬液。(2)经小鼠尾静脉注射阳离子载基因微泡0.2ml，在超声造影模式下观察微泡增强肿瘤显像情况。(3)将20只荷瘤小鼠随机分为以下4组分别进行处理：①生理盐水对照组，②质粒+超声组，③空白微泡+超声组，④单独阳离子载基因微泡组，⑤阳离子载基因微泡+超声组。微泡经尾静脉输注，超声辐照在注射后立即进行，采用本研究所研制的超声基因转染治疗仪辐照整个肿瘤部位，辐照条件：1MHz、2W/cm2，辐照10s，间隔5s，共5min。每周处理两次，连续三周。首次处理前以游标卡尺测量肿瘤长、短径，随后每周测量两次。然后计算肿瘤体积，描绘生长曲线。实验结束后，处死小鼠，剥取肿瘤称重，计算抑瘤率，并以石蜡包埋、切片，通过免疫组化染色，计算肿瘤微血管密度(MVD)结果:在超声造影模式下，经小鼠尾静脉注射载基因微泡后5 s，小鼠移植瘤部位出现微泡充盈，10 s达到高峰，增强持续时间超过10 min。肿瘤生长曲线显示，超声破坏载内皮抑素基因微泡治疗能明显抑制肿瘤的生长，该治疗组肿瘤体积明显小于其他组；肿瘤生长明显较对照组和其他组缓慢，而改组抑瘤率最高，达70.1％。免疫组化结果显示，超声破坏载基因微泡组肿瘤微血管密度(MVD)表达最低，质粒+超声组和单独载基因微泡组其次，空白微泡+超声组未显示明显的抗肿瘤作用。结论:载基因阳离子微泡能显著增强H22小鼠肿瘤超声显像，为靶向抗肿瘤治疗提供了条件。超声破坏微泡介导内皮抑素基因转染能够抑制H22小鼠移植瘤的生长，对肿瘤血管生成具有显著的抑制作用，从而为肝癌抗血管生成疗法提供了一种新的途径。