临床常见革兰氏阳性球菌蛋白指纹库的构建

摘要

目的：建立包含金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌共5种临床常见革兰氏阳性球菌蛋白指纹模型的蛋白指纹库，并通过与分子生物学方法鉴定结果比较，验证其诊断效率，为细菌快速鉴定奠定基础。
　　方法：1.收集从临床中分离获得的革兰氏阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌50株、表皮葡萄球菌30株、溶血性葡萄球菌45株、粪肠球菌30株和屎肠球菌30株，共185株。2.利用16S rDNA测序技术对所收集的细菌进行分子生物学鉴定。3.利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱检测细菌蛋白，ProteinChip和Biomarker Wizard软件自动采集数据，并分析所得的细菌蛋白指纹图谱。4.通过多次检测同一株细菌蛋白并分析其蛋白指纹图谱差异，评价此检测方法的重复性。5.通过比较同种细菌不同株之间蛋白指纹图谱差异，分析细菌蛋白表达的稳定性。6.通过比较不同培养时间下细菌蛋白指纹图谱差异，验证培养时间对细菌蛋白指纹图谱的影响。7.将185株菌株分成建模组和验证组，建模组包括5种细菌各20株，其余85株为验证组；分别检测其蛋白表达，分析其蛋白指纹图谱，筛选出建模组每种细菌各自稳定表达的蛋白峰，对每个蛋白峰的分子量求均值，构建各种细菌的蛋白指纹模型，并将数据导入自建的Fingerwave软件建立临床常见革兰氏阳性球菌的蛋白指纹库。8.将验证组细菌的蛋白峰数据与蛋白指纹库中蛋白峰数据进行相似度分析，相似度最高的为验证组细菌的鉴定结果。该结果与传统方法学及分子生物学鉴定结果进行比较，以评价其鉴定符合率。
　　结果：1.PCR产物测序结果显示，各实验菌株目的片段DNA序列与GenBank中该菌株基因序列一致性≥98.5％，鉴定为相应的细菌(均与传统的微生物鉴定结果相符)。2.在分子量3000-20000Da范围内，5种革兰氏阳性球菌有各自特异的蛋白指纹图谱。3.SELDI-TOF MS检测细菌蛋白的孔间重复性和芯片间重复性好，同一株细菌多次重复的蛋白指纹图谱相似。4.同种细菌不同株之间蛋白指纹图谱表达稳定，共有蛋白峰分子量变异系数≤0.5％。5.不同培养时间对细菌蛋白指纹图谱影响不大。6.该研究筛选了5种细菌各自稳定表达的蛋白峰，建立了包含5种临床常见革兰氏阳性球菌的蛋白指纹库。7.利用建立的数据库对验证组菌株进行鉴定，结果与应用传统微生物学鉴定及分子生物学方法获得的鉴定结果的符合率为100％。
　　结论：利用SELDI-FOF MS技术结合自建Fingerwave软件鉴定临床常见革兰氏阳性球菌，为细菌的快速鉴定提供了新方法，进一步扩大并完善该研究中建立的蛋白指纹库，将为临床病原菌的快速鉴定提供可能。