神经肽P物质在高氧诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中的作用及其对SHH信号通路影响的研究

摘要

第一部分，神经肽P物质在高氧诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中的作用
　　背景：
　　氧疗是临床上治疗呼吸系统疾病的常用方法，但长时间高浓度氧，可产生大量的氧自由基，超过细胞的防御能力，从而引起炎症，细胞损伤，坏死和凋亡相关基因的过表达，从而致各种急性或慢性肺损伤。肺泡上皮细胞是高氧暴露后氧化损伤的主要靶点，其损伤后的修复主要依靠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的增殖、分化为肺泡I型上皮细胞(AECⅠ)。AECⅡ细胞的功能状态是决定肺损伤病理转归的主要因素。
　　神经肽P物质(SP)广泛分布于气道上皮细胞层内，可启动早期的神经源性炎性反应，参与对损伤细胞的修复、增殖、迁移、分化调控。本课题组前期研究发现神经肽P物质能够降低高氧诱导的氧化损伤，但调节的分子机制尚不完全清楚。
　　目的：
　　(1)早产鼠AECⅡ的体外分离、培养、纯化及鉴定，以及氧化损伤细胞模型的建立。
　　(2)高氧暴露对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的氧化损伤以及神经肽P物质(SP)对AECⅡ的保护作用。
　　方法：
　　(1)原代分离培养孕19d早产鼠AECⅡ，随机分为4组：空气组、高氧组、高氧+SP组、高氧+SP+SP拮抗剂组。空气组和高氧组分别置于氧体积分数为0.21的空气和氧体积分数为0.95的氧气中暴露24h；高氧+SP组在置于空气或高氧环境前加入SP；高氧+SP+SP拮抗剂组同时加入SP和SP受体拮抗剂L703.606后，再置于氧体积分数为0.95的氧气中培养24h。
　　(2)倒置相差显微镜及电镜下观察高氧暴露及神经肽P物质干预对AECⅡ细胞的形态变化。
　　(3)DCFH-DA分子探针法检查细胞内ROS水平。
　　(4)MTT法和Annexin-V和PI双染色法分别检测细胞存活率和凋亡率。
　　结果：
　　与空气组比较，高氧组暴露24 h，光镜和电镜观察AECⅡ出现明显的氧化损伤，活性氧水平明显增加，进一步检测可见细胞凋亡率明显增加，存活率明显降低。神经肽SP预处理后形态学观察可见细胞损伤明显减轻，其活性氧水平明显降低，凋亡率明显降低，存活率明显升高。然而，神经肽SP受体拮抗剂L703.606干预后上述的保护作用明显减弱，细胞氧化损伤较神经肽SP预处理组明显增加。
　　结论：
　　高氧暴露24小时，可导致早产鼠AECⅡ发生氧化性损伤，诱导细胞凋亡。而神经肽SP可部分减轻AECⅡ的氧化损伤，减少凋亡，促进细胞存活，对高氧损伤的AECⅡ起保护作用。
　　第二部分，神经肽P物质调控SHH信号通路在高氧肺损伤中的研究
　　背景：
　　SHH信号通路是一种重要的信号转导通路，在细胞损伤修复中有着重要的作用。SHH产生有生物学活性的N末端片段(Shh-N)，与其受体Patched1(Ptch1)结合。通过Hedgehog信号复合物(Hedgehogsignaling complex)介导，使信号转录因子Gli进入细胞核内，进一步激活其下游信号分子，起到基因和蛋白调控作用。大量研究表明SHH信号通路在胚胎形成，组织修复，创伤愈合，肿瘤形成方面有重要作用。在鼠肺组织，研究发现Shh信号通路在肺的形态发生和器官形成中起着至关重要的作用。
　　前一部分已经证实了神经肽SP可部分减轻AECⅡ的氧化损伤，减少凋亡，促进细胞存活，对高氧损伤的AECⅡ起保护作用。然而SP降低氧化损伤的机制尚不明确，是否与调控Shh信号通路有关，目前研究甚少。本部分进一步研究SP干预对高氧暴露下AECⅡ的损伤的作用，及是否有SHH信号通路的参与及SHH信号通路的调控机制。
　　目的：
　　(1)早产鼠AECⅡ的原代培养及氧化损伤细胞模型的建立。
　　(2)研究高氧暴露及SP干预对早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)中的SHH信号通路分子的活化情况，从而研究是否有SHH信号通路的参与及神经肽P物质(SP)干预对SHH信号通路的调控作用。
　　方法：
　　(1)早产鼠AECⅡ的体外分离、培养、纯化及鉴定，以及氧化损伤细胞模型的建立。
　　(2)荧光定量PCR检测高氧暴露及SP干预对AECⅡ中SHH信号通路分子Shh和Patched1(Ptch1)基因表达的影响。
　　(3)Western-Blot检测高氧暴露及SP干预对AECⅡ中SHH信号通路分子Shh和Patched1(Ptch1)基因表达的影响。
　　结果：
　　与空气组比较，高氧暴露24 h后，AECⅡ内SHH信号通路分子shhmRNA和蛋白水平明显升高(P<0.05)，而Patched1 mRNA和蛋白表达水平明显降低。SP干预后，可促进高氧组AECⅡ内Shh信号通路激活，高氧+SP组Shh和Patched1 mRNA水平较单纯高氧组明显升高(P<0.05)。而L703.606干预后可明显逆转上述SP的作用。
　　结论：
　　SHH信号通路参与了高氧诱导细胞凋亡的信号转导系统，介导了神经肽SP对细胞的信号转导过程，参与了对高氧诱导AECⅡ损伤的保护作用，其通路的各分子，执行了SHH信号途径的保护作用。