转录因子Blimp1和BCDA在系统性红斑狼疮中高表达的意义研究

摘要

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)简称红斑狼疮，是由多克隆自身反应性物B细胞介导的自身免疫性疾病，其直接的致病因子是多克隆自身抗体，并以免疫复合物的形式造成多种组织器官损伤。对于引起SLE的确切病因仍然不很明确，但是自身抗体对SLE的发病起到了很重要的作用已是共识。目前临床上治疗SLE最常用的措施是使用非特异性免疫抑制剂、细胞毒药物和激素，尽管这些药物能有效地抑制免疫活性细胞，控制疾病病程，但毒副作用比较明显，另一方面由于用药后自身反应性淋巴细胞持续存在，因此很难达到治愈的目的。近年来针对分化为浆细胞产生抗体的B淋巴细胞治疗红斑狼疮虽然取得了很大进展，但是此策略因为不能有效清除浆细胞，体内长寿浆细胞依然分泌自身抗体，这些抗体可再次激活病理性免疫应答反应，进而导致SLE患者复发，所以寻求针对分泌抗体的浆细胞的新靶标成为核心问题。
　　目的：
　　本研究旨在探索重庆地区活动性系统性红斑狼疮患者，外周血促B淋巴细胞成熟蛋白1(Blimpl/PRDMl)、B淋巴细胞成熟抗原(BCDA)表达和CD138+浆细胞数量和健康人之间的是否存在差异，揭示PRDM1、BCDA表达与CD138+浆细胞数量之间的关系。同时通过红斑狼疮动物模型和正常动物对比，了解Blimp1在动物不同组织的表达情况，以及揭示Blimp1与红斑狼疮之间的关系。本研究的开展将明确Blimp1可否成为以浆细胞为靶细胞治疗红斑狼疮，为进一步开发治疗红斑狼疮的新药奠定基础，还可以为治疗其他浆细胞相关疾病的药物设计提供新的策略
　　方法
　　1.收集40例SLE患者血液标本为实验组，30例健康体检血液标本为对照组。提取外周血单个核细胞总RNA、逆转录得到cDNA，再进行荧光定量PCR(FQ-PCR)，根据相对定量法计算PRDM1、BCMAmRNA相对表达情况。
　　2.收集40例SLE患者血液标本为实验组，30例健康体检血液标本为对照组。Ficoll梯度离心收集外周血单个核细胞，按照CD38-FITC，CD56-PE，CD45-PC5；CD19-FITC，CD138-PE，CD45-PC5；IgG1-PE/IgG1-FITC/IgG1-PC5，CD45-PC5三组标记细胞，流式细胞技术研究CD138+浆细胞量的差异。
　　3.红斑狼疮模型小鼠和正常对照小鼠在16周龄时乙醚麻醉处死，取肾脏、脾脏及淋巴结组织，行免疫组化、免疫印迹、HE染色，观察Blimpl蛋白表达以及病理变化。提取上述组织总RNA，行RT-PCR和电泳，测量Blimp1凝胶光密度OD值，计算模型小鼠和正常小鼠Blimpl mRNA表达相对倍数。
　　结果
　　1.经过SPSS13.0统计软件t检验计算得出SLE实验组PRDM1和BCMA的△ct值和体检对照组的△ct值有统计学意义(P<0.05)。结果实验组PRDM1△ct为0.67，BCMA△ct为0.81；对照组PRDM1△ct是1.74，BCMA△ct为1.72。通过相对定量2-△△ct法计算，得到SLE实验组的PRDM1 mRNA的含量是体检对照组的2.09倍，SLE实验组的BCMA mRNA的含量是体检对照组的1.87倍。
　　2.用流式细胞技术分析，结果提示SLE患者和健康对照者外周血CD138+浆细胞数量差异明显。
　　3.经Imagepro-Plus6.0软件检测免疫组化(IHC)光密度OD值，结果显示Blimpl蛋白在SLE模型小鼠的肾脏、脾脏及淋巴结组织内表达明显高于正常小鼠，具有统计学意义(P均小于0.05)。其结果显示Blimpl蛋白在SLE模型小鼠的肾脏、淋巴结及脾脏组织表达分别是正常小鼠的1.57、1.86、2.00倍。经quantity one软件分析Western Blot，PCR产物电泳凝胶的光密度OD值(P均小于0.05)，Western Blot果结显示Blimpl蛋白在SLE模型小鼠的肾脏、淋巴结及脾脏组织表达分别是正常小鼠的1.54、1.99、2.21倍；Blimpl mRN，A在SLE模型小鼠的肾脏、淋巴结及脾脏组织表达分别是正常小鼠的1.76、2.02、2.05倍。HE染色结果显示肾脏间质内有少量炎细胞浸润，局灶性浆细胞、淋巴细胞及少量巨噬细胞浸润。偶见肾小球内细胞数增多，基底膜略增厚。淋巴结淋巴滤泡增生，生发中心扩大。脾脏脾小体明、暗区结构正常，偶见红髓中多核巨细胞增生明显，小动脉周增生及出现少量浆细胞。
　　结论：
　　1.证实在SLE患者外周血PRDM1和BCMA mRNA高表达，CD138+浆细胞数量的增多与PRDM和BCMA高表达相关。PRDM1和BCMA mRNA高度表达，它们刺激浆细胞的分化、成熟，分泌抗体，这些抗体产生了一系列的病理性免疫反应，造成多种临床表现。
　　2.初步证实Blimp1蛋白和Blimp1 mRNA在系统性红斑狼疮模型小鼠肾脏、淋巴及脾脏组织表达较高；组织病理变化与人类系统性红斑狼疮疾病特相符合符合。这为进一步的研究奠定了良好的基础。