降脂药普罗布考改善大鼠非酒精性脂肪性肝炎的机制研究

摘要

第一部分建立非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型及普罗布考对该模型大鼠血清学指标及肝脏病理的影响
　　目的：1、模拟人体非酒精性脂肪性肝炎的发病过程，建立可靠的非酒精性脂肪性肝炎的大鼠模型。2、探讨降脂药物普罗布考对非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清学相关指标的影响，及对肝脏病理的改善作用。
　　方法：雄性SD大鼠40只，随机分4组：(1)正常对照组(10只)，予以普通饲料；(2)高脂组(10只)，予以高脂饲料(饲料成分为：15％猪油，2％胆固醇，83％普通饲料)；(3)普罗布考对照组(10只)，予以普通饲料同时加普罗布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)；(4)普罗布考干预组(10只)，予以高脂饲料同时加普罗布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)。喂养15周后处死大鼠，抽取心脏血液行血清学指标水平的检测：(1)一般指标：转氨酶、血脂、血糖、胰岛素，同时计算胰岛素抵抗指数(Insulin resistance index，IRI)；(2)ELISA法测定血清脂肪因子脂联素(adiponectin)、及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度。同时取肝组织：(1)测定大鼠肝重、体重并计算其比值；(2)部分肝组织固定、包埋、切片、行HE染色，然后进行非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfatty liver disease，NAFLD)活动度积分(a NAFLD activity score，NAS)评定，病理评分采用2005年美国国立卫生研究院非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)临床研究网病理工作组所制定的标准。
　　结果：与高脂组比较，普罗布考干预组大鼠体重无显著差异(466.7±30.9g vs439.4±47.3g，p>0.05)，但其肝重(21.1±1.3g vs17.6±3.6g，p<0.05)，及肝脏湿重/体重比值显著降低(0.045±0.0043vs0.039±0.007，p<0.05)。
　　与高脂组比较，普罗布考干预组血清ALT(126.40±52.56U/L vs80.18±22.90U/L，p<0.01)、AST(250.40±30.45U/L vs179.45±41.14U/L，p<0.01)及胆固醇(2.7±.0.2mmol/L vs2.4±0.3mmol/L，p<0.01)、游离脂肪酸(0.734±.0.11mmol/L vs0.557±0.19mmol/L，p<0.05)显著降低，甘油三脂水平无显著差异(0.9±0.3 vs0.8±0.1，p>0.05)。
　　与高脂组比较，普罗布考干预组空腹血糖无显著降低(7.41±0.56mmol/Lvs6.91±0.21mmol/L，p>0.05)、空腹胰岛素水平(15.75±2.14mU/L vs12.02±1.90mU/L，p<0.01)及胰岛素抵抗指数(5.21±1.00 vs3.72±0.70，p<0.01)均显著降低。
　　与高脂组比较，普罗布考干预组血清脂联素水平显著升高(11.98±2.28μg/ml/Lvs15.31±2.41μg/ml，p<0.05)，而炎症反应因子肿瘤坏死因子-α仅水平显著降低(311.0±40.3pg/ml/Lvs162.8±28.9pg/ml，p<0.01)。
　　HE染色病理结果提示：与高脂组比较，普罗布考干预组脂肪变性显著减轻(3.00±0.00 vs2.10+0.316，p<0.01)，炎症浸润显著降低(2.30±0.48 vs1.00±0.471，p<0.05)，但两组气球样变无显著差异(0.30±0.48 vs0.20±0.421，p>0.05)。
　　结论：通过高脂喂养建立了非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型。普罗布考显著降低了NASH大鼠肝重及肝重/体重比。显著降低了血清转氨酶ALT、AST、血清胆固醇及游离脂肪酸水平。显著改善脂肪变性及炎症浸润。并有改善胰岛素抵抗的作用。
　　第二部分普罗布考对非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂肪细胞大小、分泌及合成功能的影响
　　目的：探讨普罗布考对NASH大鼠脂肪细胞大小的影响，探讨普罗布考对NASH大鼠脂肪细胞脂质合成及脂肪因子脂联素分泌功能的影响。
　　方法：雄性SD大鼠40只，随机分4组：(1)正常对照组(10只)，予以普通饲料；(2)高脂组(10只)，予以高脂饲料(饲料组分为：15％猪油，2％胆固醇，83％普通饲料)；(3)普罗布考对照组(10只)，予以普通饲料同时加普罗布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)；(4)普罗布考干预组(10只)，予以高脂饲料同时加普罗布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)。15周后处死大鼠取脂肪组织组织固定、包埋、切片、行 HE染色，以NIS-Elements BR3.2软件进行定量分析，计算分析各组脂肪细胞的直径及面积平均值差异。提取脂肪组织的RNA及蛋白质，RT-PCR方法测定脂肪组织中脂联素mRAN的表达，Western Blot方法检测脂肪组织中p-AMPK，ACC1蛋白的表达水平。
　　结果：高脂喂养组脂肪细胞的直径及面积较正常对照组显著增加(p<0.05)，普罗布考干预组脂肪细胞的直径及面积较高脂喂养组显著减小(p<0.05)。高脂喂养组的脂肪细胞分泌脂联素的水平较正常组显著降低(p<0.05)，经普罗布考干预治疗后，脂联素的mRNA表达水平有显著上升(p<0.05)。与高脂组比较，普罗布考干预组p-AMPK水平显著增高(p<0.05)，而ACC1的蛋白表达水平显著降低(p<0.05)。
　　结论：普罗布考可缩小高脂喂养大鼠组脂肪细胞的大小(直径、面积)，增加脂肪细胞脂联素的分泌，通过AMPK途径降低脂肪细胞脂肪酸的合成。
　　第三部分普罗布考对非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂质代谢、氧化应激及炎症应激的改善作用
　　目的：探讨普罗布考改善大鼠非酒精性脂肪性肝炎脂质代谢的分子机制，探讨普罗布考对NASH大鼠肝脏氧化应激及炎症应激状态的影响。
　　方法：雄性SD大鼠40只，随机分4组：(1)正常对照组(10只)，予以普通饲料；(2)高脂组(10只)，予以高脂饲料(饲料组分为：15％猪油，2％胆固醇，83％普通饲料)；(3)普罗布考对照组(10只)，予以普通饲料同时加普罗布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)；(4)普罗布考干预组(10只)，予以高脂饲料同时加普罗布考灌胃(500mg/Kg/天，15周)。15周后处死大鼠取肝组织迅速放入液氮中备检测。以RT-PCR的方法检测LXR-α，SREBP-1c、FAS、ACC1的mRNA表达水平，以Western Blot检测方法检测肝脏p-AMPK、LXR-α、SREBP-1c、ACC1及HMG-CoA reducase的蛋白表达水平。用免疫组织化学染色法检测NF-κB蛋白在肝脏表达情况。提取肝脏蛋白做氧化应激相关指标MDA、SOD、GSH-Px、及CAT的检测。
　　结果：与正常组比较，高脂喂养组LXR-α、SREBP-1c、FAS、ACC1mRNA及蛋白表达水平显著上升(p<0.05)，p-AMPK蛋白表达显著下降(p<0.05)，HGM-CoA reducase蛋白表达水平显著上升(p<0.05)。与高脂组比较，经普罗布考干预治疗后，大鼠肝组织LXR-α、SREBP-1c、FAS、ACC1 mRNA及蛋白表达水平显著降低(p<0.05)，AMPK显著增高(p<0.05)，HGM-CoA reducase蛋白表达水平显著降低(p<0.05)。免疫组化提示与高脂组比较，普罗布考干预治疗组NF-κB蛋白的表达水平下调(p<0.05)。与正常对照组比较，高脂喂养组的MDA水平显著增高，而抗氧化应激酶SOD、CAT、GSH-Px则显著降低(p<0.05)，经普罗布考干预治疗后，MDA的水平较高脂组显著降低(p<0.05)，SOD、CAT、GSH-Px显著增高(p<0.05)。与正常组比较，高脂喂养组肝内TNF-α mRNA表达显著增高(p<0.05)，经普罗布考干预治疗后，其表达显著降低(p<0.05)。
　　结论：普罗布考可通过影响脂质代谢合成中基因及蛋白的表达，降低大鼠肝内脂质的从头合成，及通过抗氧化应激及炎症应激的作用改善肝脏炎症浸润，延缓NASH的发展。