课题一：RNAi抑制USP18的表达对IFNα抗HBV效应的体外研究；课题二：干扰素刺激基因的特异性染色预测慢性乙型肝炎α干扰素疗效的初步研究

摘要

本研究分为二部分：
　　课题一：RNAi抑制USP18的表达对IFNα抗HBV效应的体外研究
　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是所有国家公共的卫生问题，已有2亿多人被影响。虽然从1982年就有高效的乙肝病毒疫苗，可是仍有4.0多亿慢性携带者，而且其中75％的携带者在亚洲太平洋地区。慢性HBV感染导致的肝炎后肝硬化和肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）等终末期肝病，目前已成为危害中国人民生命健康的主要疾病。近些年来虽然有新型抗HBV药物不断出现，但是其疗效不尽如人意，仍然需要探索新型的抗HBV的治疗方法。α干扰素是抗HBV药物之一，然而有相当部分病人无应答。这些无应答的患者中α干扰素不敏感的机制是难以捉摸的。在前期研究中我们发现预测慢性乙型肝炎患者α干扰素治疗前的肝组织中一些干扰素刺激基因的表达增加与α干扰素治疗无应答组有关。因此，深入了解RNAi抑制泛素特异性肽酶（ubiquitin specific peptidase18，USP18）的表达以及调控具有重要的意义。
　　目的：应用RNA干扰技术构建重组USP18 RNAi慢病毒载体，并且筛选出最有显著抑制USP18表达的重组RNAi慢病毒载体；然后转染 HepG2.2.15细胞后观察 HBV DNA及干扰素敏感基因15（IFN-sensitive gene，ISG15）的表达。
　　方法：在本研究中，我们在体外化学合成针对USP18基因的三个靶点siRNA序列（siRNA1,siRNA2,siRNA3），以慢病毒载体介导下构建重组USP18 RNAi慢病毒载体，转染HepG2.2.15细胞5天后，实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测USP18 mRNA的表达水平，从中筛选抑制率最高的重组USP18 RNAi慢病毒载体；然后再转染HepG2.2.15细胞时加入长效聚乙二醇干扰素（Pegylated interferon alfa-2a，PEG-IFNα），分五组，A组和B组为重组 siRNA慢病毒载体转染组，C组和D组为未转染组，E组为空白组；其中，A组和C组培养于含有PEG-IFNα、含10%胎牛血清的MEM培养液中， B组和D组培养于含10%胎牛血清的MEM培养液中。即A组为PEG-IFNα+USP18-RNAi-LV1＃， B组为USP18-RNAi-LV1＃， C组为 PEG-IFNα+NC-GFP-LV， D组为NC-GFP-LV，E组为空白组），在8小时、3天、7天后三个时间点收集HepG2.2.15细胞的上清液检测HBV DNA的复制，并在感染后3天收集HepG2.2.15细胞的蛋白用Western blot检测ISG15蛋白的表达。
　　结果：我们成功地构建了重组USP18 RNAi慢病毒载体（即USP18-RNAi-LV1＃，USP18-RNAi-LV2＃，USP18-RNAi-LV3＃）。在重组USP18 RNAi慢病毒载体转染HepG2.2.15细胞5天后，real-time PCR结果表明：所设计的siRNA1,siRNA2,siRNA3组重组慢病毒载体与对照组（阴性组：NC-GFP-LV，空白组）相比均有不同程度地抑制USP18 mRNA的表达，且成功筛选出最有效地抑制USP18表达的重组慢病毒载体USP18-RNAi-LV1＃﹙P＜0.05﹚。然后重组慢病毒载体USP18-RNAi-LV1＃转染HepG2.2.15细胞后，随着时间的推移，对HBV的复制抑制作用越来越显著，尤其A组。而Western blot结果提示A组的ISG15蛋白表达增加，进一步证实了上述结果,在蛋白水平得到了进一步验证抑制USP18的表达能增强α干扰素抗病毒的活性，具有一定的临床意义。
　　结论：通过上述实验成功构建了USP18 RNAi重组慢病毒载体，通过抑制USP18的表达增强α干扰素的抗病毒作用，为慢性乙型肝炎患者的治疗带来新的希望。相信随着该领域研究的不断深入，应用RNA干扰技术沉默USP18的表达在抗HBV方面有较大的临床应用前景。
　　课题二：干扰素刺激基因的特异性染色预测慢性乙型肝炎α干扰素疗效的初步研究
　　α干扰素是目前抗乙型肝炎病毒公认的主要药物之一，但是只有部分患者有效。这些无效的患者中α干扰素不敏感的机制是难以捉摸的。在前期我们研究中发现预测慢性乙型肝炎患者α干扰素治疗前的肝组织中一些干扰素刺激基因的表达增加与治疗无效组相关。
　　目的：我们研究慢性乙型肝炎患者α干扰素治疗前的肝组织中和正常肝组织中干扰素刺激基因ISG15和MxA的细胞特异性染色，拟从蛋白水平预测慢乙肝患者IFN-α的疗效。
　　方法：我们采用免疫组化技术检测慢性乙型肝炎患者α干扰素治疗前的肝组织中和正常肝组织中干扰素刺激基因 ISG15和 MxA的表达，其表达形式与治疗疗效有关。
　　结果：慢乙肝患者IFN-α治疗前肝组织中有效组ISG15和 MxA蛋白的染色主要集中MACROPHAGE内，而无效组主要集中在肝细胞内。在正常的肝组织中 ISG15和 MxA偶有在肝细胞中表达。
　　结论：ISG15和 MxA在慢乙肝患者 IFN-α治疗前的肝组织中有效组与无效组有明显统计学差异，因此干扰素刺激基因的免疫染色有可能成为预测慢乙肝患者IFN-α的疗效指标。

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英汉缩略语名词对照

课题一：RNAi抑制USP18的表达对IFNα抗HBV效应的体外研究1

摘要

ABSTRACT

第一部分 ：USP18基因RNAi重组慢病毒表达载体的构建与筛选

前言

1 材料及方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分：抑制USP18对慢性乙型肝炎α干扰素疗效的研究

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

课 题 一 小 结

课题二：干扰素刺激基因的特异性染色预测慢性乙型肝炎α干扰素疗效的初步研究

摘要

ABSTRACT

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

课 题 二 小 结

文献综述: HBV基因分型的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的论文