Mir-34a靶向调控NOTCH1基因对SW480细胞增殖影响及其机制

摘要

第一部分Hsa-miR-34a靶基因的生物信息学预测及分析
　　目的:为了估测和评价miR-34a的目的靶基因，我们通过在线生物信息网站，采用生物信息技术和计算机技术，从而获得hsa-miR-34a参与的转录后调控机制的信息。方法:以hsa-miR-34a作为检索词在miRGen数据库搜索，调取miRanda，PicTar及TargetScanS三种在线软件预测的交集，选出与细胞增殖密切相关的基因。结果:通过GO注释软件得到8个与肿瘤增殖相关的基因。NOTCH1参与细胞增殖等重要生理活动并且起了关键作用，因此我们分析可能的靶基因NOTCH1，发现NOTCH1基因的3' UTR段与miR-34a的有不完全互补序列，且在多物种有高度的保守性及较低的结合自由能。结论:miR-34a可能参与的多个目的靶基因的调控，NOTCH1很可能是miR-34a的一个靶基因。
　　第二部分miR-34a靶向调控NOTCH1基因对SW480细胞增殖的影响
　　目的:探讨miR-34a靶向调控Notch1基因表达而对结肠癌SW480细胞增殖的影响。方法:通过生物信息学预测，Notch1为miR-34a特异性靶基因。构建含miR-34a结合位点的Notch1基因3'-UTR域荧光素酶报告载体。通过荧光素酶报告载体系统检测miR-34a与Notch1的3'-UTR相互作用对荧光素酶活性的影响;免疫印迹技术检测miR-34a对Notch1蛋白表达的影响。采用MTT法及流式细胞检测转染miR-34a对SW480细胞增殖的影响。结果:经过酶切及基因测序鉴定，Notch1基因3'-UTR序列的双荧光素酶报告重组质粒构建成功;并且miR-34a与Notch1的3'-UTR位点相结合。免疫印迹结果提示miR-34a负性调控Notch1蛋白的表达。miR-34a过表达后能抑制SW480细胞增殖。结论:miR-34a负性靶向调控Notch1基因的表达而抑制SW480细胞的增殖。
　　第三部分miR-34a靶向调控NOTCH1基因抑制肠癌SW480细胞增殖的分子机制研究
　　目的:探讨miR-34a靶向调控NOTCH1基因抑制SW480细胞增殖的分子机制。方法:SW480细胞分别使用NOTCH1基因的干扰质粒si(pLenti6-NOTCH1-shRNA)及对照(si-nc)进行转染;NOTCH1的表达质粒(pNL-NICD)和对照(nc)分别转染SW480-miR-34a细胞。Westernblot分别检测NOTCH1的干扰组和过表达组中NOTCH1及p53蛋白的表达水平。结果:相对于SW480组而言，pLenti6-NOTCH1-shRNA组能显著地抑制NOTCH1基因的表达，其抑制率为43.94％(p=0.000)，而相应的p53蛋白表达增加了82％(p=0.040)。而pLenti6组的NOTCH1与p53蛋白表达无明显差异。相对于SW480-miR-34a组而言，pNL-NICD组明显地增加NOTCH1基因的表达，其上升率为60.5％(p=0.000)，而相应的p53蛋白表达下降了48.1％(p=0.035)。而pNL组的NOTCH1与p53蛋白表达无明显差异。结论:miR-34a对SW480细胞的生长的抑制作用至少部分是通过靶向调控NOTCH1的表达，上调p53蛋白的表达水平实现的。
　　第四部分miR-34a对大肠癌SW480细胞在裸鼠移植瘤生长的影响
　　目的:探讨miR-34a对大肠癌SW480细胞对裸鼠移植瘤生长的影响及其分子机制。方法:在BALB/c鼠腋部皮下分别接种W480细胞、SW480-miR-34a细胞及SW480-control细胞，观察各组裸鼠的成瘤情况，通过测量肿瘤长短径来绘制生长曲线;通过测量移植瘤的重量计算抑瘤率。用HE染色观察各组瘤组织的形态学改变;用免疫组化法及免疫印迹法检测各组瘤组织中NOTCH1和P53的表达情况。结果:相对于种植SW480细胞组的裸鼠而言，种植SW480-miR-34a细胞组的裸鼠的成瘤速度明显减慢，且瘤体重量明显减少(F=1598，P＜0.01)，抑瘤率为73.60％，与种植SW480-control细胞组在成瘤速度和移植瘤的重量之间的差异无统计学意义(F=2.635，P=0.821)。HE染色显示:SW480-miR-34a细胞组的移植瘤的肿瘤细胞体积，核浆比例及核分裂相所占比例比SW480组和SW480-contrl组均明显缩小。免疫印迹及免疫组化显示:SW480-miR-34a细胞组的移植瘤中的NOTCH1的蛋白表达比SW480细胞组明显降低(P＜0.01)，两者之间的差异具有统计学意义。而SW480-control细胞组的NOTCH1蛋白表达与SW480组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:miR-34a可以下调NOTCH1蛋白的表达来抑制结肠癌SW480细胞在裸鼠体内的生长。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 Hsa-miR-34a靶基因的生物信息学预测及分析

前言

1 方法

2 结果

3 讨论

4 小结

5 结论

参考文献

第二部分 miR-34a靶向调控NOTCH1基因的表达研究

第一节 NOTCH1基因3’-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

前言

1 材料与方法

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

6 结论

参考文献

第二节 miR-34a靶向调控NOTCH1基因的表达

前言

1 材料与方法

2 方法

3 统计学分析

4 结果

5 讨论

6 小结

7 结论

参考文献

第三节 Notch1在结直肠中表达与临床预后的关系

前言

1 材料

2 方法

3 统计方法

4 结果

5 讨论

参考文献

第三部分 miR-34a靶向调控NOTCH1基因对大肠癌SW480细胞增殖的影响及分子机制

第一节 miR-34a过表达慢病毒载体的构建及对SW480细胞增殖的影响

前言

1 材料

2 实验方法

3 统计学方法

4 结果

5 讨论

6 小结

7 结论

参考文献

第二节 miR-34a靶向调控NOTCH1基因抑制大肠癌SW480细胞增殖的机制

前言

1 主要材料

2 实验方法

3 统计学分析

4 结果

5 讨论

6 小结

7 结论

参考文献

第四部分 miR-34a对大肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

前言

1 材料

2 实验方法

3 统计学分析

4 结果

5 讨论

6 小结

7 结论

参考文献

全文总结

文献综述 miRNA在结直肠癌中所发挥的临床意义

致谢

攻读学位期间的主要研究成果