HBV负链冗余序列区碱基组成对复制的影响

摘要

第一部分HBV负链冗余序列区碱基组成对复制的影响
　　 目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)负链冗余序列区(r)碱基组成对复制及第三次模板转换的影响。
　　 方法:利用不依赖酶切和链接的分子克隆方法(RLIC)构建负链3'r、5'r单碱基突变或者双侧r区单碱基同时突变的HBV1.1倍体质粒，分别转染HEK293细胞，提取细胞内HBV复制中间体并用Southern Blot检测;各突变质粒分别与质粒PEGFP-N1共转染HEK293细胞，提取细胞总RNA，再用Northern Blot检测HBV RNA。
　　 结果:与野生型相比，3'r和至少部分5'r单碱基突变型的细胞内HBV DNA总量及rcDNA的量没有明显改变;双侧r区T1821G突变体导致细胞内各种形态的HBV DNA均显著降低，而双侧r区nt1820、nt1822、nt1823碱基同时突变不显著影响HBV DNA的复制水平;双侧r区T1821G突变体的pgRNA量为野生型的43.9％，而两种单侧T1821G突变体pgRNA转录水平与野生型相当。
　　 结论:负链3'r和至少部分5'r单个位置的碱基组成对HBV复制及第三次模板转换没有明显影响;双侧r区T1821G突变能显著降低HBVDNA复制水平，这种效应具有位置和碱基特异性;双侧r区T1821G突变降低HBV DNA复制的效应至少部分可由pgRNA转录水平降低来解释，而该种突变究竟通过何种机制导致pgRNA减少有待进一步研究。
　　 第二部分HBV M蛋白N末端序列对S结构域包装功能影响的探索研究
　　 目的:观察HBV中(M)蛋白N末端序列对S结构域包装功能的影响。
　　 方法:利用不依赖酶切和链接的分子克隆方法(RLIC)构建M蛋白和S蛋白表达缺失的HBV1.1倍体质粒，利用酶切连接的方法构建表达M蛋白、S蛋白、N末端不同程度截短的M蛋白的质粒;将突变质粒和表达质粒共转染HepG2细胞，用Southern Blot检测培养上清中是否存在病毒复制中间体。
　　 结果:成功构建了M蛋白和S蛋白表达缺失的HBV1.1倍体质粒，表达M蛋白、S蛋白、N末端不同程度截短的M蛋白的质粒;在不能表达M蛋白和S蛋白的HBV培养上清中检测到病毒复制中间体，与在反式提供S蛋白后培养上清的病毒复制中间体的检测量相当。
　　 结论:核心颗粒可以不依赖外膜蛋白而释放出胞;我们需要建立分离完整病毒颗粒的免疫沉淀方法，来检测细胞培养上清中是否含有完成外膜包装的病毒颗粒。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

第一部分 HB7负链冗余序列区碱基组成对复制的影响

摘要

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

第二部分 HBV M蛋白N末端序列对S结构域包装功能影响的探索研究

摘要

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

文献综述 HBV外膜蛋白包装病毒颗粒的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文