重组腺病毒介导siBPR-Ⅱ抑制UHMWPE诱导破骨细胞分化成熟的作用

摘要

人工关节置换术在治疗类风湿性关节炎、骨关节炎、股骨头坏死以及老年性髋部骨折等方面，已经取得巨大成功，它能显著改善患者的运动功能和生存质量。人工关节松动失效是术后严重的并发症。近年研究发现，假体周围产生的磨损颗粒，诱导破骨细胞过度分化成熟，引起局部骨溶解是导致人工关节晚期无菌松动的最重要因素。防治术后无菌松动的关键即是抑制局部破骨细胞过度激活所引起的骨溶解效应。最近几年发现BMPs可直接或间接调控破骨细胞的分化成熟，使我们思考是否可以通过RNA干扰技术沉默BMP受体，干扰BMP通路来抑制破骨细胞的分化成熟，因为它可以作用于破骨前体细胞本身，也可调控成骨细胞对破骨细胞的影响，这将对抑制破骨细胞的分化成熟起到双管齐下的作用，这是其它靶点及信号通路所不具备的。
　　 目的：
　　 构建重组腺病毒siRNA-BMPR-Ⅱ，观察其在UHMWPE诱导溶骨的小鼠植骨气囊模型中，抑制破骨细胞分化成熟及骨溶解的作用。并通过体外培养原代成骨细胞与原代破骨前体细胞，观察siBMPR是否具有抑制破骨前体细胞向具有溶骨作用的成熟破骨细胞分化的间接或直接调控作用。
　　 方法
　　 1.将选定的siBMPR-Ⅱ基因片段应用到改良的AdEasy系统中，将siBMPR-Ⅱ基因片段克隆连接到pSES-HUS穿梭质粒上，构成pSES-HUS-siBMPR-Ⅱ质粒。在基因测序后，正确的重组质粒被Pmel酶线性化，与骨架质粒pAdEasy-1一起转导到感受态细胞Escherichiacoii BJ5183中，构成pAd-siBMPR-Ⅱ质粒。并通过脂质体2000转染到293T细胞中进行病毒包装。测定病毒滴度，获得携带siBMPR-Ⅱ的重组腺病毒。
　　 2.在体内研究中，首先建立小鼠植骨气囊聚乙烯颗粒（UHMWPE）诱导破骨细胞形成的溶骨模型。通过real-time PCR、Western blot、破骨细胞TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色，相关蛋白免疫组织化学与免疫荧光等实验方法，检测各处理组局部破骨细胞数量及溶骨情况。观察siBMPR在体内是否能抑制UHMwPE颗粒引起的破骨细胞过度分化成熟，减少局部溶骨的作用。
　　 3.体外实验:原代成骨细胞与原代破骨前体细胞培养体系的建立。A:原代成骨细胞的分离培养与纯化。B:原代破骨前体细胞分离与纯化。
　　 (1)在原代破骨前体细胞培养体系中:
　　 通过检测经siBMPR处理过后破骨细胞形成的标志性基因及蛋白的表达，以及破骨细胞的特殊染色（抗酒石酸酸性磷酸酶染色）观察BMP信号通路直接调控破骨细胞分化成熟的作用。
　　 (2)在原代成骨细胞培养体系中:
　　 通过检测经siBMPR处理过后的成骨细胞RANKL、OPG的基因及蛋白表达情况，用以观察siBMPR作用于破骨细胞分化成熟是否是通过间接调控作用。
　　 结果
　　 1.成功构建表达siBMPR-Ⅱ的重组腺病毒。并通过real-time PCR，Western blot检测，重组腺病毒siBMPR-Ⅱ可明显减降破骨前体细胞BMPR-Ⅱ基因与蛋白的表达。
　　 2.证实在UHMWPE诱导溶骨的小鼠植骨气囊模型中，通过siRNA干扰BMPR-Ⅱ的表达，可以明显抑制破骨细胞的分化成熟及骨的溶解。
　　 3.通过体外培养原代成骨细胞与原代破骨前体细胞，观察得到siBMPR-Ⅱ可以直接抑制破骨前体细胞向具有溶骨作用的成熟破骨细胞的分化，以及调控成骨细胞OPG/RANKL的表达，间接抑制破骨细胞的分化成熟。
　　 结论
　　 本课题揭示了在磨损颗粒引起的局部溶解模型中，局部注射重组腺病毒siBMPR-Ⅱ可有效的起到抑制破骨细胞分化成熟与骨溶解的作用。同时也证实了BMPR-Ⅱ信号通路可直接或间接调控破骨细胞的分化成熟。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 构建重组腺病毒siBMPR-Ⅱ及验证基因沉默效果

前言

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第二部分 重组腺病毒siBMPR-Ⅱ在UHMWPE诱导破骨细胞过度激活的小鼠植骨气囊模型中抑制破骨细胞分化成熟及骨溶解

前言

1．技术路线

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

参考文献

第三部分 重组腺病毒siBMPR-Ⅱ直接或间接调控破骨细胞形成的相关实验研究

前言

1．技术路线

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

参考文献

全文总结

附：与本课题相关的一些实验研究

文献综述 RANKL-RANK-OPG调节轴在破骨细胞分化成熟中的作用

致谢

攻读博士学位期间发表的论文