骨髓间充质干细胞肿瘤微环境直接培养模型构建及其生物学特性分析

摘要

目的：
　　通过构建SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derivedmesenchymal stem cells，BMSCs)与大鼠来源C6脑胶质瘤细胞直接共培养模型，探讨BMSCs与C6脑胶质瘤细胞直接共培养后BMSCs是否发生瘤样转化;通过构建BMSCs原位注射C6脑胶质瘤荷瘤裸鼠模型，为BMSCs在C6脑胶质瘤活体内瘤样转化的研究提供基础模型，从而为BMSCs作为靶向治疗载体安全用于临床提供实验依据。
　　材料与方法：
　　1.实验动物
　　SPF级SD大鼠，3-4周龄，体重约40-60 g;裸鼠，雌性，5-6周龄，体重约18-20g，均购于重庆医科大学实验动物中心。
　　2.细胞来源
　　全骨髓贴壁筛选法分离培养SD大鼠BMSCs; C6脑胶质瘤细胞系和293细胞系均由重庆医科大学附属儿童医院“儿童发育与疾病研究教育部重点实验室”肿瘤研究室惠赠;
　　3.实验分组
　　本研究分为两部分，第一部分分为三组:(1)实验组:细胞膜荧光染料CM-Dil标记的BMSCs(CM-Dil+BMSCs)与C6脑胶质瘤细胞直接共培养;(2)阳性对照组:C6脑胶质瘤细胞单独培养;(3)阴性对照组:BMSCs单独培养。第二部分分为两组:(1)实验组:原位注射绿色荧光蛋白基因重组腺病毒载体(Ad-GFP)标记BMSCs(Ad-GFP+BMSCs)的C6脑胶质瘤荷瘤裸鼠;(2)阳性对照组:未注射Ad-GFP+BMSCs的荷瘤裸鼠。
　　4.实验方法
　　4.1全骨髓贴壁筛选法分离培养SD大鼠BMSCs，倒置显微镜观察细胞形态。
　　4.2免疫荧光(Immunoflurescence，IF)法检测CD90、CD105、CD45、GFAP蛋白表达情况。
　　4.3流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测感染效率、分选直接共培养组BMSCs。
　　4.4 RT-PCR检测各组GFAP、PTEN、Bcl-xl、CyclinD1、CD90、CD105基因的表达水平。
　　4.5HE染色法观察肿瘤组织细胞形态结构。
　　结果：
　　1.BMSCs培养至第三代时，细胞形态、性质均一。IF结果显示90％以上BMSCs表达CD90分子、CD105分子，不表达CD45分子。BMSCs与C6脑胶质瘤细胞直接共培养7d后，BMSCs表达酸性胶质纤维蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）水平较阴性对照组明显增高;BMSCs表面阳性分子CD90、CD105表达较阴性对照组明显减弱。
　　2.FCM结果显示CM-Dil标记BMSCs标记效率为98.3％; Ad-GFP感染BMSCs72h后感染病毒量0ul、5ul、6ul、8ul、10ul、15ul组感染效率分别为0.22％、8.58％、29.03％、36.54％、42.27％、51.43％。
　　3.RT-PCR结果显示BMSCs与C6脑胶质瘤细胞直接共培养7d后，BMSCs表达GFAP、PTEN、Bcl-x1、CyclinD1基因水平较阴性对照组明显增高(P＜0.05); BMSCs表达CD90、CD105基因水平较阴性对照组明显降低(P＜0.05)。
　　4.HE染色结合激光共聚焦结果显示BMSCs原位注射到荷瘤裸鼠瘤体7d后，BMSCs仍存活，通过Ad-GFP绿色荧光信号对瘤体内的BMSCs进行定位。
　　结论：
　　1.BMSCs在与C6脑胶质瘤细胞直接共培养后，其表面分子发生了改变且肿瘤相关基因表达增高，提示BMSCs在C6脑胶质瘤细胞微环境中存在瘤样转化倾向。
　　2.Ad-GFP标记的BMSCs原位注射到C6脑胶质瘤瘤体中可以存活并通过荧光标记进行定位，可以做为BMSCs在C6脑胶质瘤活体内瘤样转化研究的基础模型。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 骨髓间充质干细胞肿瘤微环境直接培养后瘤样转化的生物学特性分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二部分 骨髓间充质干细胞在荷瘤载体生长模型构建

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文总结

文献综述 骨髓间充质干细胞标记示踪研究进展

致谢

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