ATRA调控BMP9诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨和成脂分化的作用及机制研究

摘要

骨质疏松症在骨量减少的同时往往还伴有骨髓内脂肪组织的异常增多，表明骨髓内过多的脂肪组织与骨形成减少有着密切的关系。骨髓中成骨细胞和脂肪细胞均来源于骨髓间充质干细胞(Mesenchymelstem cells，MSCs)。正常情况下，MSCs的成骨分化和成脂分化受到多种细胞因子和激素的调控，表现为一种相互关联和制约的平衡状态。而在骨质疏松症发生时，MSCs的成骨分化和成脂分化出现失衡，并以一种牺牲成骨细胞数量为代价的方式产生过多的脂肪细胞，最终导致骨量减少。因此，各种原因引起的MSCs成骨和成脂分化失衡是导致骨质疏松发生的一个重要原因。
　　MSCs分化为成熟脂肪细胞的过程包括两个阶段，首先MSCs向脂肪细胞谱系定型为前脂肪细胞，随后前脂肪细胞再在一系列细胞因子的作用下进一步分化为成熟的脂肪细胞。因此，如果以MSCs成脂分化过程中产生的前脂肪细胞作为干预对象，并用细胞因子诱导该细胞向成骨细胞转分化，那么不仅能够减少骨髓内脂肪组织含量，同时还能增加成骨细胞数量，进而促进骨形成，有望为骨质疏松症的治疗开创一种新的方式。那么，寻找一种能发挥该作用的细胞因子成为了目前研究的关键和热点问题。
　　研究发现，骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)在诱导前脂肪细胞成骨分化中发挥着重要的作用。BMPs属于转化生长因子超家族成员，目前已经鉴定了超过20种BMP亚型。通过对14种BMPs进行系统性分析，发现BMP9也具有成骨诱导活性，并且其作用强于BMP2和BMP7等传统的成骨性BMP。然而，BMP9是否同样能诱导已经向脂肪细胞谱系定型前脂肪细胞成骨分化目前尚无报道。
　　因此，本文研究了BMP9是否能够诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨分化。结果发现，BMP9能够增加3T3-L1前脂肪细胞中早期成骨分化指标碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)的活性。此外，BMP9还能促进晚期成骨指标(Osteocalcin，OCN)和骨桥素(Osteopotin，OPN)在前脂肪细胞中的表达，并促进细胞外基质矿化。但是，我们也发现BMP9同时也明显促进了前脂肪细胞中脂质的积聚。动物实验结果也显示，BMP9能够诱导3T3-L1前脂肪细胞在体内异位成骨，但成骨包块中也有伴有大量脂肪细胞存在。以上结果表明，BMP9不仅能够诱导前脂肪细胞成骨分化，也能促进其成脂分化。
　　尽管在BMP家族中BMP9是诱导成骨活性最强的成员，但是其他细胞因子能够进一步增强BMP9的成骨诱导作用。因此，为了进一步增强BMP9诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨分化的作用并抑制BMP9促进3T3-L1前脂肪细胞成脂分化，可能需要选用其他细胞因子对BMP9在前脂肪细胞中的生物学作用进行调控。
　　维甲酸(Retinoic acid，RA)是维生素A的衍生物。研究表明RA能够促进BMP介导的骨形成并抑制BMP诱导的成脂分化。因此我们选取了RA在体内的主要存在形式—全反式维甲酸(All-tans RA，ATRA)，与BMP9共同作用于3T3-L1前脂肪细胞。通过体内外实验，研究了ATRA对BMP9介导的3T3-L1前脂肪细胞成骨或成脂分化的影响。结果发现，ATRA不仅能够增强BMP9诱导前脂肪细胞成骨分化的作用，还能抑制BMP9诱导前脂肪细胞成脂分化。
　　在对ATRA调控BMP9诱导前脂肪细胞成骨和成脂分化的机制研究中，我们发现ATRA能够上调BMP9的表达，增强BMP9介导的Smad信号活性，并能进一步上调BMP9激活的成骨相关转录因子的表达和抑制BMP9诱导的成脂相关转录因子的表达。此外，我们还发现ATRA和BMP9均能激活经典Wnt/β-catenin信号，并且二者具有协同作用。利用RNA干扰（RNA interfere，RNAi）技术抑制Wnt/β-catenin信号能够减弱ATRA促进BMP9诱导前脂肪细胞成骨分化和抑制BMP9诱导前脂肪细胞成脂分化的作用。相反，激活Wnt/β-catenin信号则能促进BMP9诱导前脂肪细胞成骨分化并抑制BMP9诱导的成脂分化。此外，研究还发现BMP9能调控一系列Wnt配体和受体在3T3-L1前脂肪细胞中的表达，进一步表明了Wnt/β-catenin信号参与了BMP9诱导前脂肪细胞分化的过程。最后，我们还发现ATRA和BMP9可能是通过PI3K/Akt/GSK3β信号途径激活经典Wnt信号。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 ATRA对BMP9诱导前脂肪细胞3T3-L1成骨和成脂分化的影响

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

参考文献

附图

第二部分 ATRA对BMP9在3T3-L1前脂肪细胞中介导的BMPR-Smad信号通路的影响

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

参考文献

附图

第三部分 ATRA通过Wnt／β-catenin信号通路调控BMP9诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨和成脂分化

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

参考文献

附图

全文结论

文献综述 调控间充质干细胞成骨和成脂分化信号通路研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文