载利福喷丁微球复合磷酸钙骨水泥缓释系统的制备及相关基础研究

摘要

第一部分载利福喷丁/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的制备及理化性能研究
　　目的：
　　制备具有较高载药量和包封率的载利福喷丁/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球(Rifapentine-loadedpoly(lactic-co-glycolicacid)microspheres,RPMs)，并探讨不同利福喷丁投药量对RPMs理化性能的影响。
　　方法：
　　通过oil-in-water乳化-溶剂挥发法制备RPMs，光学显微镜和扫描电镜观察微球形貌，红外光谱仪分析微球的结构组成，激光粒度分析仪测定微球粒径及分布，紫外分光光度计测定计算微球的载药量及包封率。
　　结果：
　　RPMs绝大多数呈球形，分散性好，未载药微球表面光滑，载药后微球表面出现浅凹而变得不平整，投药量增加，凹陷数量明显增多，深度加深而变成微孔。与未载药微球的红外光谱图谱相比较发现，载药微球的特征性吸收峰未出现明显移位，但在2192cm-1处出现了利福喷丁原药的特征性羧基伸缩振动峰。当利福喷丁投药量为0mg,20mg,50mg和100mg时，微球的平均粒径分别为12.422±0.372μm、16.737±0.52μm、25.267±0.318μm和27.833±0.485μm，随着利福喷丁投药量的增加，微球的平均粒径逐渐增大(p＜0.05)。利福喷丁投药量为20mg,50mg和100mg时，载利福喷丁微球的载药量分别为8.04±0.29％，17.16±0.40%和23.93±0.48%，载药量逐渐增加(p＜0.05)，差异有统计学意义；包封率分别为88.49±3.23%，85.78±2.00%和71.80±1.45%，包封率降低(p＜0.05)，差异有统计学意义。
　　结论：
　　采用乳化-溶剂挥发法制备的RPMs具有良好的成球形貌，随利福喷丁投药量增加，微球平均粒径增大，载药量增加，而包封率降低。以200mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物及50mg利福喷丁为投药量所制备的RPMs具有较高的载药量和包封率，分别为17.16%±0.40%和85.78%±2.00%。
　　第二部分载利福喷丁/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的体外性能研究
　　目的：
　　研究载利福喷丁/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球(Rifapentine-loadedpoly(lactic-co-glycolicacid)microspheres,RPMs)的体外释放特性，评估RPMs体外抗菌性能，为后续研究及其临床试用提供前期实验依据。
　　方法：
　　采用乳化-溶剂挥发法制备不同载药量的RPMs，将RPMs样品加入磷酸盐缓冲溶液中进行体外释放实验，绘制体外释放曲线，并对体外释放曲线进行零级释放方程、一级释放方程和Higuichi释放方程的拟合分析。采用琼脂扩散实验和最低抑菌浓度实验评估RPMs的体外抗菌性能。
　　结果：
　　制备了载药量分别为8.04±0.29%，17.16±0.40%和23.93±0.48%的三种RPMs。不同载药量RPMs体外释放均呈突释相和缓释相的两相释放。突释相累积释放药物百分数分别为9.07±0.11%，13.33±0.04%和15.5±0.09%，整个释放间期累积释放药物百分数分别为72.10±0.26%、80.22±0.56%和78.60±0.63%。对不同载药量RPMs微球的体外累积释放曲线进行拟合，均是Higuichi方程的相关系数更接近于1。利福喷丁原药的抑菌圈直径和最低抑菌浓度分别为21.88±0.40μm和5μg/ml。8.04%RPMs、17.16%RPMs和23.93%RPMs的抑菌圈直径分别为7.62±1.02μm、11.27±0.58μm和13.38±1.01μm，最低抑菌浓度分别为320μg/mL、80μg/ml和40μg/ml，随微球中利福喷丁的载药量增加，抑菌圈直径逐渐增加(p＜0.05)，最低抑菌浓度也逐渐降低(p＜0.05)，差异具有统计学意义。
　　结论：
　　载利福喷丁/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的体外释放呈突释相和缓释相的两相释放，不同载药量微球体外释放均更加符合Higuichi方程释放规律。随载药量增加，RPMs的抑菌圈直径增加，最低抑菌浓度降低。载药量为23.93±0.48%%的载利福喷丁/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球能较长时间释放高于最低抑菌浓度的药物，具有良好的抗菌活性，将用于本文后续研究。
　　第三部分载利福喷丁微球复合磷酸钙骨水泥缓释系统的制备及相关基础研究
　　目的：
　　评估载利福喷丁/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球复合磷酸钙骨水泥(Rifapentineloadedpoly(lactic-co-glycolicacid)microspheres-calciumphosphatecement,RPMs-CPC)缓释系统的理化性能、体外释放特性、细胞毒性和动物体内修复股骨髁临界骨缺损的能力，为临床应用提供前期实验依据。
　　方法：
　　采用“枣糕镶嵌”原理制备RPMs-CPC复合材料，采用扫描电镜、红外光谱、X线衍射能谱、孔隙率、固化时间和力学性能等对RPMs-CPC复合材料的理化性能进行表征。在磷酸盐缓冲溶液中进行体外释放实验。RPMs-CPC复合材料浸提液与骨髓间充质干细胞共培养，评估其体外细胞毒性。18只新西兰大白兔随机分为2组：利福喷丁-CPC对照组和30%RPMs-CPC实验组。建立股骨髁临界骨缺损模型，各组动物分别植入相应材料。术后4周、8周和12周处死动物取样，进行大体观察和组织病理观察。术后12周取动物肝、肾、脾等组织进行组织学观察。
　　结果：
　　载利福喷丁/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球(Rifapentineloadedpoly(lactic-co-glycolicacid)microspheres,RPMs)均匀地分布在CPC基质中。红外光谱和X线衍射能谱分析没有发现特征峰的位移，没有出现新的吸收峰，表明负载RPMs的过程没有形成新的化学键，也没有改变磷酸钙骨水泥的水化反应。负载RPMs后，CPC材料孔隙率增加、初始固化时间和最终固化时间延长，力学性能降低(p＜0.05)。纯CPC骨水泥的孔隙率为46.72±1.01%，初始固化时间和最终固化时间分别为2.0±0.11min和22.6±0.73min，抗压强度为47.31±2.83MPa。30wt%RPMs-CPC复合材料的总孔隙率为73.56±0.87%，初始固化时间和最终固化时间分别为4.6±0.27min和36.4±2.14min，抗压强度为21.30±3.25MPa。RPMs-CPC复合材料体外释放曲线未见明显突释现象，随负载RPMs增多，释放量和累积释放百分数均增加。10wt%RPMs-CPC每日释放利福喷丁的量约8μg，20wt%RPMs-CPC约为20μg，而30wt%RPMs-CPC每日释放量约41μg。仅30wt%RPMs-CPC每日释放药物浓度高于利福喷丁的最低抑菌浓度，因此选择30wt%RPMs-CPC复合材料进行骨植入实验。骨植入实验发现，所有实验动物手术切口愈合良好，无明显红肿、流脓等感染征象。股骨髁及周围软组织无脓液形成，材料植入部位及其周围组织内未见明显炎性细胞浸润。术后12周组织学观察发现，利福喷丁-CPC组仅少量植入材料降解，骨缺损的周围区域有少量骨样组织形成。30wt%RPMs-CPC组大量材料降解，骨缺损周围及中央区域有大量新骨长入，部分新生骨组织已完成塑型，骨缺损修复良好。术后12周，两组动物的肝、肾、脾等组织切片中未见明显炎性细胞浸润和宿主细胞坏死征象。
　　结论：
　　载利福喷丁/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球复合磷酸钙骨水泥复合材料具有良好的体外细胞相容性，在体外能够持续释放利福喷丁药物，植入兔股骨髁骨缺损后无明显炎性反应，具有良好的体内组织相容性，并能有效修复骨缺损。这种集高效抗痨和结核性骨缺损修复能力为一体的复合材料可作为一种安全、长效的骨关节结核辅助治疗新手段，具有良好的临床应用前景。

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分 载利福喷丁/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的制备及理化性能研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

6 附图

参考文献

第二部分 载利福喷丁/聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球的体外性能研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

6 附图

参考文献

第三部分 载利福喷丁微球复合磷酸钙骨水泥缓释系统的制备及基础研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

6 附图

参考文献

全文结论

后续研究工作计划

文献综述: 局部载药系统在骨关节感染性疾病治疗中的研究与应用

致谢

攻读学位论文期间的学术成果