高强度聚焦超声辐照抑制小鼠黑色素瘤转移的机制研究

摘要

研究背景与目的：
　　黑色素瘤是死亡率最高的皮肤病，恶性程度极高，在病程早期就可转移。转移是决定该疾病患者生存率和预后的关键因素之一，也是当前治疗中的难题。因此，抑制其转移是提高生存率的关键。
　　高强度聚焦超声消融或辐照（High intensity focused ultrasound， HIFU消融或辐照）是一种无创性的肿瘤热消融治疗手段，该技术从1990年开始在我国兴起。其原理是将体外低能量的超声聚集于体内待治疗的组织，利用超声波的特性，在靶点内产生瞬间高温等效应实现精确地靶区内细胞的消融，而不影响周围组织。目前HIFU消融广泛应用在子宫肌瘤、乳腺癌等多种良恶性实体瘤的临床治疗中，而且疗效显著。但对于HIFU应用在黑色素瘤治疗及其机制方面的研究较少。
　　microRNAs(miRNAs)是一类体内非编码小RNA，长度约为18~25个核苷酸，其在转录后水平来参与调控各个靶基因表达，从而参与调节恶性肿瘤的发生、发展的多个环节。近几年，有研究显示miRNAs与肿瘤物理治疗相关，例如：辐射耐受性、放射离子所诱导残留细胞的凋亡等生物效应。在为了改善放疗效果的治疗策略中，miRNAs是很有前景的新靶点，尤其microRNA-21（miRNA-21）。HIFU作为一种新型的物理治疗肿瘤的方法，对于其机制的研究，主要关注物理效应（热凝固效应和空化效应），较少关注miRNAs等生物分子是否参与其中。
　　HIFU消融对肿瘤原发灶的治疗作用已毋庸置疑，但在临床实际消融过程中，因为设备、影像、人员操作等技术原因和肿瘤部位、肿瘤大小等病灶本身的因素，想要完全将肿瘤病灶消融有相当难度，因此临床实际消融中不可避免的会有肿瘤细胞残留，而它们的生物学行为则是在消融原发灶之后决定疗效和预后的关键要素。有研究表明射频消融在治疗肝癌时会加速残留肝癌细胞的增殖。那么，HIFU消融后残留的肿瘤细胞的增殖和凋亡能力、尤其是对患者预后起决定性作用的远处转移能力会怎样变化呢？这些问题的答案对于HIFU消融是否适用于临床黑色素瘤的治疗至关重要。
　　基于上述，本研究拟在体内外探讨HIFU处理后残留黑色素瘤细胞的生物学行为的变化，并重点关注对黑色素瘤患者的预后起关键作用的残瘤细胞转移能力的变化及其潜在机制。旨在为HIFU消融应用于黑色素瘤的临床治疗提供依据。
　　方法：
　　1.HIFU消融对残留的小鼠黑色素瘤生长、转移的影响：
　　1）构建小鼠皮下黑色素瘤模型，进行HIFU消融，记录消融后皮下瘤体的体积变化，TUNEL试验检测残留细胞中凋亡细胞数。
　　2)通过记录皮下黑色素瘤肺转移的发生率和计数肺部转移灶的数目来反应残留细胞的转移能力；通过qPCR检测小鼠血循环中黑色素瘤细胞的数量，以反映HIFU消融后残留肿瘤细胞由原发部位脱落入血的能力；同时，在辐照后第14天尾静脉注射同种肿瘤细胞进行再刺激，观察 HIFU辐照对同种肿瘤细胞在肺部定植能力的影响。再通过western blot和免疫组织化学染色探讨转移相关分子 E-cadherin、Vimentin、VEGF和 MMP9在残留组织中表达的变化，以探讨 HIFU影响残留肿瘤转移的潜在机制。
　　2.在体外HIFU辐照小鼠黑色素瘤细胞B16-F10，辐照时间为1s、2s、3s，辐照后将细胞放在培养皿中，继续培养12h后去除不贴壁的细胞，将有贴壁能力的细胞作为残留细胞，分别采用台盼蓝拒染试验、MTT试验、流式细胞术、划痕试验和 transwell试验来检测其存活、增殖、凋亡和迁移行为的改变，并与体内实验结果相比较。
　　3.HIFU辐照抑制残留黑色素瘤细胞迁移能力及减少肺转移的分子机制探讨：
　　1）通过qPCR、western blot和免疫组织化学验证miRNA-21及其潜在靶基因PTEN在HIFU处理的肿瘤组织和细胞中表达的变化，以及其下游AKT信号通路的活化程度。
　　2）经过荧光素酶活性分析和 western blot验证 B16-F10细胞中miRNA-21对PTEN表达的靶向调控作用。
　　3）用划痕试验和transwell试验验证miRNA-21和PTEN在HIFU辐照抑制残留B16-F10细胞迁移中的作用。
　　结果：
　　1.HIFU消融延长小鼠存活时间，抑制残留黑色素瘤的生长，减少黑色素瘤的肺转移。
　　1）与对照组比，HIFU消融组小鼠生存期延长（P<0.0001）。两组小鼠皮下瘤体积在 HIFU处理后即刻并无明显差异，但从HIFU后第20天开始出现显著差异，HIFU组瘤体体积小于假照组（P<0.05，n=15）；TUNEL试验显示HIFU后14天的残余组织中正处于凋亡期的细胞数明显多于对照组（P<0.01）。
　　2）肉眼观察时，对照组肺转移发生率为20％(3/15)，且每只小鼠的肺上有黑色转移灶为1.67±0.58个；HIFU组15只小鼠中肉眼观察时没有发现有肺部转移，仅有的一例转移灶是在组织切片、H-E染色后在显微镜下才能发现的转移灶，故HIFU组转移率为6.7%(1/15)。
　　3）qPCR结果显示 HIFU组在消融后第7天血中的 MAGE-A3、MART-1和 PAX3的表达量分别为0.578±0.482，0.822±0.309，0.794±0.356；对照组分别为3.183±0.323，1.416±1.374，1.654±1.290。两组的三个指标的差异都有显著性（P<0.05）；在HIFU消融后第14天，其 MAGE-A3的表达量为0.882±0.514，仍然显著低于对照组（4.852±2.583，P<0.05）。提示：HIFU辐照减少血液循环中的黑色素瘤细胞。
　　4）在HIFU消融后第14天，尾静脉注射B16-F10细胞，HIFU组肺部形成的转移结节数为26.4±6.6/鼠，对照组为45.8±7.6/鼠（P<0.05， n=10）。提示HIFU辐照可降低肿瘤细胞在肺部的定植能力。
　　5）经过western blot和免疫组织化学染色发现，HIFU组上皮细胞的标志物E-cadherin表达升高(P<0.05)，间质细胞的标志物Vimentin表达有降低趋势(P>0.05)；同时，VEGF和MMP9表达明显低于对照组(P<0.05)。提示HIFU辐照可以部分逆转EMT、抑制VEGF和MMP9的表达。
　　2. HIFU辐照1s、2s和3s后的B16-F10细胞的存活率、增殖能力、凋亡细胞数与对照组相比均无明显差异（P>0.05），但48h的划痕愈合率则明显低于对照组(P<0.001)，穿膜细胞数也显著低于对照组(P1s<0.05, P2s<0.001, P3s<0.001)。提示HIFU辐照抑制残留B16-F10细胞的迁移能力。
　　3.HIFU辐照通过减少miRNA-21表达从而上调其靶基因PTEN，进而抑制残留的小鼠黑色素瘤细胞的迁移。
　　1)在残留肿瘤组织和残留细胞中：qPCR显示，miRNA-21明显低于假照组（P<0.001,P<0.05）；western blot显示其潜在靶基因PTEN的表达升高（ P<0.05,P<0.05），其下游的 AKT信号通路的活化形式p-Akt(T308)/t-Akt和 p-Akt(S473)/t-Akt的相对表达量则明显降低（P<0.05, P<0.05）。提示：HIFU处理下调miRNA-21，从而上调其潜在靶基因PTEN，进而抑制其下游Akt通路的活化。
　　2)荧光素酶活性分析显示，在加入 miRNA-21 mimic和预测的PTEN-3’UTR中与miRNA-21互补的序列后，报告基因荧光素酶的活性下降，以1号互补序列特别显著（P<0.05），而加入miRNA-21的阴性对照序列或突变型PTEN-3’非编码互补序列后荧光素酶的活性没有显著变化。证明在B16-F10细胞中miRNA-21直接靶向PTEN。3)加入anti-miRNA-21并HIFU辐照后，残留细胞的划痕愈合率明显降低（P<0.01），穿膜细胞数也有明显减少（P<0.01）；但，在加入anti-miRNA-21后再加入psiPTEN以敲低PTEN的表达后，残留细胞的划痕愈合率和穿膜细胞数又部分恢复（P<0.01）。提示：HIFU辐照通过下调miRNA-21从而升高PTEN的表达来抑制残留黑色素瘤细胞在体外的迁移能力。
　　结论：
　　1.HIFU消融延长小鼠的存活时间，对残留小鼠皮下黑色素瘤有抑制生长、促进凋亡的作用。
　　2.HIFU辐照抑制残留小鼠黑色素瘤细胞在体外的迁移及在体内的肺转移。
　　3. HIFU消融减少原发部位的肿瘤细胞入血，其机制可能与其部分逆转残留细胞的EMT有关；同时，HIFU消融还抑制血循环中的肿瘤细胞在肺部的定植。
　　4.HIFU通过下调miRNA-21从而上调其靶基因PTEN的表达、抑制下游的AKT信号活性，这可能是HIFU辐照抑制黑色素瘤转移的机制之一。
　　本研究为阐明HIFU消融抑制肿瘤转移的机制和HIFU技术在临床上应用于黑色素瘤治疗提供了新思路，积累了新的实验及理论依据。

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英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分 高强度聚焦超声消融对小鼠黑色素瘤的治疗作用及对残留肿瘤细胞的影响

1材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 高强度聚焦超声辐照对残留的小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的影响

1 材料与方法

2 结果

3讨论

4小结

参考文献

第三部分 高强度聚焦超声辐照抑制残留的小鼠黑色素瘤细胞B16-F10迁移的机制

1 材料与方法

2 结果

3讨论

4小结

参考文献

全文总结

文献综述: 高强度聚焦超声（HIFU）

致谢

硕士期间发表的论文