调控PI3K/mTORC2信号通路对肺泡上皮钠离子通道作用机制的研究

摘要

急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征是呼吸危重症医学的研究重点及难点。其病理特征是由多种原因致肺微血管通透性增高，从而导致肺泡渗出富含蛋白质的水肿液及透明膜形成。临床表现为呼吸窘迫、非心源性肺水肿及顽固性低氧血症。由于其发病机制复杂，机理且尚未完全阐明，故至今仍缺乏高效的治疗手段，导致极高的病死率。ALI/ARDS发生时，因肺泡腔内含有过多的水肿液聚集，含水量为正常的3-4倍，从而导致气体交换障碍，引起顽固性低氧血症及肺水肿，改善肺泡液的清除能力是治疗该病的关键。研究发现如果能有效地清除肺泡腔内过多的水肿液，对维持气体交换和改善患者氧合至关重要，可明显降低ARDS患者的病死率。肺泡上皮钠通道是肺泡腔内钠水转运和推动水肿液清除的重要环节。因此，研究调控ENaC相关的上游信号通路，找到具有高效特异性的新治疗靶点，为改善该疾病治疗新进展、提高ALI/ARDS治疗生存率提供理论依据。
　　目的：通过药物干预PI3K/mTORC2信号通路以及构建针对mTORC2特异组成蛋白中rictor基因的重组慢病毒沉默载体，研究mTORC2/SGK1信号通路对肺泡上皮细胞钠离子通道（epithelial sodium channelα-subunit）表达的影响。并探讨其在急性呼吸窘迫综合征（ acute respiratory distress syndrome，ARDS）及急性肺损伤（acute lung injury，ALI）中的作用。
　　方法：
　　1.胰岛素、雷帕霉素及PP242干预A549细胞系，观察PI3K/mTORC2信号通路下游rictor、SGK、ENaC-α，β，γmRNA及蛋白表达的情况。
　　2.细胞免疫荧光实验观测各组药物作用后的细胞系中SGK、ENaC-α的结合和分布情况，初步探讨几者之间的关联。
　　3.构建目的基因的shRNA-rictor干扰质粒和阴性对照组并与慢病毒包装体系共转染293T细胞，收集病毒上清后进行离心、浓缩及纯化后获取重组慢病毒。感染目的A549细胞并筛选细胞稳定株。采用PCR和western blot法检测该研究通路中下游各信号指标表达情况。
　　结果：
　　1.相比空白组，在胰岛素组中Rictor、SGK1、ENaC mRNA及蛋白表达明显增高，在PP242组中Rictor、SGK1、ENaC mRNA及蛋白表达明显降低。相比PP242组相比，雷帕霉素组中Rictor、SGK1、ENaC mRNA及蛋白表达无明显改变。
　　2.相比空白组，在胰岛素组中SGK1、ENaC荧光结合能力明显增强，在PP242组中SGK1、ENaC荧光结合能力明显下降，而雷帕霉素组无明显改变。
　　3.成功构建沉默rictor基因的重组慢病毒和感染A549细胞，并获得细胞稳定株。与空白组及阴性对照组相比，shRNA-rictor组中rictor和下游SGK1、α-ENaC mRNA及蛋白表达水平明显下降。
　　结论：
　　1. ENaC受PI3K/mTORC2/SGK1信号通路的调控。
　　2.通过慢病毒载体干扰mTORC2复合体中rictor大分子，发现其对mTORC2/SGK1通路中的下游信号有明显的调控作用，同时从基因和蛋白水平影响肺泡上皮细胞ENaC的表达。

目录

封面

目录

英汉缩略语名词对照

中文摘要

英文摘要

前言

第一章 mTORC2与SGK1相关性及其对肺泡上皮钠离子通道调控机制的探讨

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二章 重组慢病毒沉默rictor基因对mTORC2/SGK1信号通路及肺泡上皮钠离子通道的调控

1 材料与方法

2. 结果

3讨论

4 小结

全文总结

参考文献

文献综述: PI3k/mTORC2信号通路在肺水清除方面的研究进展

致谢

攻读硕士期间发表论文