SV40T基因介导永生化神经胶质细胞重新编程及可能机制研究

摘要

第一部分永生化细胞系的建立及验证
　　目的：建立稳定、可无限传代的永生化神经胶质细胞系，为体外神经胶质细胞的生理及病理研究提供稳定、可靠的细胞来源。
　　方法：体外培养原代神经胶质细胞（primary glia，pGlia），利用携带 SV40T基因的工具质粒 pMPH86和携带转座酶基因的腺病毒AdR-pBase共转染使SV40T基因在宿主细胞中稳定表达，以10％的细胞密度接种pGlia和永生化神经胶质细胞（immortalized glia，iGlia）在24孔板中，于1天、3天、5天、7天进行可视细胞计数并计算倍增时间、WST-1试验、结晶紫染色测定增殖能力，以相同密度接种原代胶质细胞和永生化胶质细胞在T25培养瓶中，24小时收集细胞做流式细胞技术（FACS）测定细胞周期。采用免疫荧光染色检测各神经胶质细胞表面标志物GFAP、s100b、O4、MBP的表达情况，RT-PCR、TqPCR比较pGlia和iGlia中各表面标志物的表达。AdFLP敲除SV40T后分别用TqPCR和RT-PCR验证其敲除效率，采用结晶紫染色、WST-1及FACS测定SV40T敲除后增殖能力的改变。
　　结果：（1）以10%的细胞密度接种pGlia和iGlia在24孔板中，于1天、3天、5天、7天进行可视细胞计数发现，第1天两组细胞数目基本一致，iGlia组细胞不断增殖，第7天时，细胞数量已经增加到原来的10倍左右；而pGlia组在整个培养过程中数量增加不明显，增殖缓慢。计算两组细胞倍增时间发现iGlia约每24小时增殖分裂1次，而pGlia倍增时间约3天。WST-1试验、结晶紫染色均提示iGlia组细胞增殖活性及斜率明显高于pGlia组。FACS测定细胞周期发现pGlia组60.8％细胞处于G1期，表现出G1期阻滞未能进入DNA复制期，有丝分裂明显受到抑制。而iGlia组81.8％细胞处于S期+ G2期，即大部分细胞处于 DNA复制期及有丝分裂准备期，表明该组细胞具有强大的增殖分裂能力。（2）免疫荧光染色发现 iGlia均表达 GFAP、s100b、O4、MBP等神经胶质细胞表面标志物， RT-PCR和 TqPCR结果发现iGlia较pGlia表达 GFAP、vimentin明显下调，而MBP表达明显上调，S100b未见明显变化，表明永生化后少突胶质细胞比例增加，细胞构成比改变。（3）AdFLP能成功敲除SV40T，结晶紫染色、WST－1及FACS等结果均表明SV40T敲除后iGlia增殖能力得以逆转。
　　结论：SV40T基因以piggyBac系统为载体转入神经胶质细胞中，成功建立可逆转的永生化神经胶质细胞系（iGlia），该细胞系中星型胶质细胞比例降低，少突胶质细胞比例增加，细胞构成比发生改变，但其稳定表达神经胶质细胞的表面标志物，可作为体外神经胶质细胞生理和病理研究的工具细胞。
　　第二部分 SV40T介导iGlia重新编程
　　目的：明确iGlia细胞构成比改变原因，并确认SV40T基因是否启动iGlia重新编程。
　　方法：体外培养pGlia和iGlia，分别提取总RNA逆转录为cDNA，通过TqPCR和RT-PCR的方式比较两种细胞系多种多潜能干细胞标志物和传统重组因子、三胚层标志物的表达情况。在无血清条件下进行拟器官诱导培养pGlia和iGlia，观察细胞形态变化及细胞团生长情况，并做免疫荧光及RT-PCR明确各多潜能干细胞标志物及三胚层标志物表达情况。在体移植iGlia明确细胞生长状况及安全性。分别从体外、体内Ad-BMP9和Ad-GFP感染iGlia，通过ALP检测、ALP染色、Alcian Blue染色、Trichrome染色、HE染色、microCT等方法确认其骨分化潜能。
　　结果：（1）TqPCR筛查结果发现，iGlia多种多潜能干细胞标志物上调，并表达三胚层标志物增多，表明iGlia具有了干细胞特性。拟器官培养发现iGlia可培养成类器官，而pGlia培养中不能存活，对其免疫荧光染色发现iGlia－GFP组较iGlia－FLP组干性标志物表达增多，而分化标志物表达减少，RT－PCR发现iGlia表达三胚层表面标志物，提示其可能具有分化成三胚层的能力。用 BMP9可在体及体外诱导iGlia分化成骨和软骨，而pGlia不具有分化成骨的能力，表明SV40T赋予iGlia从外胚层分化成中胚层组织的能力。
　　结论：SV40T的插入赋予了 iGlia无限传代和多向分化潜能的干细胞特性，表明SV40T启动了iGlia的重新编程，这可能是细胞构成比改变的原因。
　　第三部分重新编程的可能机制探索
　　目的：探索SV40T介导重新编程的可能机制。
　　方法：采用TqPCR筛查iGlia和pGlia中DNA去甲基化和RNA甲基化的酶的表达情况，采用reporter－E2F和reporter－p53标记iGlia后gluc读值测定SV40T敲除前后p53通路和Rb／E2F通路中P53和E2F的变化情况，推测其是否参与SV40T的重新编程。
　　结果：（1）iGlia中Tet1/2/3表达明显高于pGlia，表明DNA去甲基化明显增强（2）iGlia－FLP和iGlia－GFP两组E2F表达没有明显差别，而前者 p53表达明显高于后者，表明 SV40T可能是通过 p53通路而发挥作用的。
　　结论：SV40T启动了iGlia细胞中的重新编程，其机制错综复杂，可能是多种重组转录因子、DNA的去甲基化增强和p53通路抑制共同作用的结果。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 永生化细胞系的建立及验证

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

第二部分 SV40T基因在iGlia中介导重新编程的发生

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分 SV40T重新编程的机制探索

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

全文总结

参考文献

附件

文献综述:重新编程的研究进展及在神经疾病中的应用

致谢

博士期间发表的论文