ICAM-1和CX3CL1对内皮细胞骨架的影响及其机制的探讨

摘要

目的：观察ICAM-1和 CX3CL1对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）骨架的影响，探讨其可能的机制。
　　方法：（1）观察ICAM-1和CX3CL1对HUVECs的骨架蛋白F-actin的影响：HUVECs饥饿处理12 h；○110μM Fg刺激HUVECs30 min后，1 nM ICAM-1分别刺激HUVECs0、30、60、120、180 min；○210 nM CX3CL1分别刺激HUVECs0、30、60、120、180 min；4％多聚甲醛固定细胞后，用Alexafluor?488 phalloidin对细胞骨架蛋白F-actin进行荧光染色，荧光显微镜下观察细胞F-actin形态和分布情况。
　　(2)检测ICAM-1和CX3CL1对HUVECs的MAPK信号通路的影响：HUVECs饥饿处理12 h；○110μM Fg刺激HUVECs30 min后1 nM ICAM-1分别刺激HUVECs0、5、15、30、60 min；○210 nM CX3CL1分别刺激HUVECs0、1、5、15、30 min；○35μg/mL抗ICAM-1+10μM Fg刺激细胞30 min后，1 nM ICAM-1刺激细胞5 min、15 min和15 min、30 min；○45μg/mL抗CX3CR1抗体刺激内皮细胞30 min后,10 nM CX3CL1刺激细胞1min和5 min；提取细胞总蛋白，Western blot检测磷酸化p38、ERK1/2和JNK1/2和总p38、ERK1/2和JNK1/2的表达水平。
　　(3)探讨ICAM-1和CX3CL1介导的HUVECs骨架改变的机制：HUVECs饥饿处理12 h；○130μM的（SB203580p38的特异性抑制剂）、PD98059（ERK1/2的特异性抑制剂）和SP600125（JNK1/2的特异性拮抗剂）分别刺激内皮细胞30 min后，10μM Fg刺激HUVECs30 min，随后1 nM ICAM-1在刺激HUVECs180 min；○230μM SB203580、PD98059和SP600125分别刺激HUVECs1 h后，10 nM CX3CL1刺激HUVECs120 min；固定细胞后，对细胞进行荧光染色，荧光显微镜下观察细胞F-actin形态和分布情况。
　　结果：(1)空白对照的HUVECs的细胞周边的F-actin形成光滑而连续的外周致密带。1 nM ICAM-1刺激HUVECs30 min后，细胞没有明显变化；60 min后胞质内出现少量应力纤维，细胞膜外周的F-actin成锯齿状，致密带被破坏；120 min后，细胞周边的F-actin基本消失，细胞质内出现大量纤细的应力纤维；180 mim后细胞质内出现密集的贯穿整个细胞的应力纤维，细胞变形。10 nM CX3CL1刺激HUVECs30 min后胞质内出现少量应力纤维，细胞外周的F-actin成锯齿状，致密带被破坏；60 min后，细胞质内出现大量纤细的应力纤维，而细胞周边的F-actin基本消失；120 min后细胞质内出现密集的贯穿整个细胞的应力纤维，细胞变形；180 min后在胞质内的应力纤维变短而稀疏。
　　(2)1nM ICAM-1刺激HUVECs5 min后p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平高于空白对照的细胞，15 min后磷酸化ERK1/2和JNK1/2的表达水平达峰值，而磷酸化p38的的表达水平在30 min后达峰值；10 nM CX3CL1刺激HUVECs1 min后p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平高于空白对照的细胞，三者的磷酸化水平均在5 min后达峰值；5μg/mL抗1nM ICAM-1抗体抑制ICAM-1介导的p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平的上调；5μg/mL抗CX3CR1抗体抑制10 nM CX3CL1介导的的p38、ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平的上调。
　　(3)30μM SB203580提前干预后，1nM ICAM-1刺激内皮细胞后引起的F-actin的重排及应力纤维的形成被抑制，30μM SB203580和PD98059提前干预后，10 nM CX3CL1刺激内皮细胞后引起的F-actin的重排及应力纤维的形成被抑制。
　　结论：(1) ICAM-1可能以时间依赖方式通过激活p38信号通路介导HUVECs细胞骨架的重构；
　　(2) CX3CL1可能以时间依赖的方式通过p38和ERK1/2信号通路介导HUVECs细胞骨架的重构。

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英汉缩略语名词对照

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英文摘要

前言

1 材料

1.1 主要药物与试剂

1.2 主要仪器

1.3 实验细胞

1.4 常用试剂的配制

2 实验方法

2.1实验设计

2.2 HUVECs培养

2.3 细胞荧光染色

2.4 Western blott检测MAPKs磷酸化水平

3 统计方法

4 结果

4.1 HUVECs的形态学特征

4.2 ICAM-1 和CX3CL1以时间依赖方式介导HUVECs的F-actin的重排和应力纤维的形成

4.3 ICAM-1和CX3CL1以时间依赖方式介导HUVECs MAPKs磷酸化水平升高

4.4 ICAM-1和CX3CL1通过MAPKs信号转导通路介导HUVEC细胞骨架重构

5 讨论

全文总结

参考文献

文献综述: Fractalkine与ANCA相关性血管炎

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文