SIRT1调控自噬对人椎间盘髓核细胞退变的影响

摘要

第一部分人椎间盘髓核组织分离、鉴定及髓核细胞培养
　　目的：掌握人椎间盘髓核细胞的分离、培养方法，为后续实验打下基础。
　　方法：采用 CollagenⅡ免疫组化、透射电镜观察鉴定从青壮年腰椎爆裂骨折及中老年脊柱退行性疾病手术中取得的椎间盘标本经分离后的髓核组织；应用0.25％胰酶、2%Ⅱ型胶原酶联合消化从中老年椎间盘突出症/腰椎滑脱症手术中取得的椎间盘经分离后的髓核组织进行细胞培养，光镜观察、CollagenⅡ免疫细胞化学鉴定髓核细胞。
　　结果：CollagenⅡ免疫组化、透射电镜观察证实从青壮年腰椎爆裂骨折及中老年脊柱退行性疾病手术中取得的椎间盘标本经分离后的部分为髓核组织；成功培养出人退变椎间盘髓核细胞，形态学观察及CollagenⅡ免疫细胞化学鉴定证实培养的为髓核细胞。
　　结论：成功分离鉴定人椎间盘髓核组织；0.25%胰酶、2%Ⅱ型胶原酶联合消化法成功培养出原代人椎间盘退变髓核细胞，并行传代培养，光镜下形态学观察、CollagenⅡ免疫细胞化学鉴定证实培养细胞为髓核细胞。
　　第二部分自噬活性在人正常椎间盘髓核细胞及退变髓核细胞中的表达及意义
　　目的：明确人正常椎间盘髓核细胞及退变髓核细胞中自噬活性的差异，SIRT1表达差异以及不同髓核细胞凋亡情况。
　　方法：电镜观察不同髓核细胞中自噬体的数量；荧光定量PCR、Western Blot方法检测不同髓核标本中SIRT1、LC3、Beclin-1的基因及蛋白表达差异；免疫组化检测不同髓核标本中SIRT1、CollagenⅡ、Caspase3的蛋白表达差异；TUNEL法检测不同髓核标本中凋亡率差异。
　　结果：退变髓核细胞中自噬体数量，SIRT1、LC3、Beclin-1的基因表达，SIRT1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、CollagenⅡ的蛋白表达均较正常髓核细胞明显降低（P＜0.05）；退变髓核细胞Caspase3蛋白表达及凋亡率较正常髓核细胞明显升高（P＜0.05）。
　　结论：本实验证实人退变髓核细胞中SIRT1低表达、自噬活性降低、细胞凋亡率增高；SIRT1与髓核细胞自噬活性呈正向关系，与细胞凋亡呈反向关系，髓核细胞自噬活性与凋亡呈反向关系。
　　第三部分 SIRT1调控自噬对人退变髓核细胞凋亡的影响及分子机制研究
　　目的：探讨SIRT1是否能够通过调节人退变髓核细胞的自噬从而调控髓核细胞凋亡及可能的分子机制。
　　方法：首先用 SIRT1激动剂 resveratrol、抑制剂 nicotinamide、SIRT1-siRNA处理退变髓核细胞后用Western Blot法检测SIRT1、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表达，用流式细胞仪检测凋亡率变化。然后resveratrol处理髓核细胞后用自噬抑制剂bafilomycin A抑制自噬，Western Blot法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、cleaved caspase3的表达，用流式细胞仪检测凋亡率变化。最后分别用PI3K抑制剂LY294002和MEK抑制剂PD98059处理髓核细胞后，Western Blot法检测Akt及Erk1/2信号通路相关蛋白激活表达情况。
　　结果：SIRT1激动剂 resveratrol处理细胞后能提高 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表达，同时降低髓核细胞凋亡率（P＜0.05）。SIRT1抑制剂nicotinamide、SIRT1-siRNA处理退变髓核细胞后降低 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表达，同时髓核细胞凋亡率增加（P＜0.05）。bafilomycin A能够提高LC3Ⅱ/Ⅰ表达（P＜0.05），使凋亡率增加（P＜0.05），同时能抵消resveratrol降低髓核细胞凋亡率的作用。Western Blot结果显示LY294002能够通过抑制 Akt磷酸化从而抑制 LC3Ⅱ/Ⅰ表达（P＜0.05），但resveratrol能部分抵消LY294002对LC3Ⅱ/Ⅰ表达的抑制作用；PD98059能够通过抑制Erk1/2的磷酸化部分降低LC3Ⅱ/Ⅰ表达，而resveratrol不能逆转PD98059抑制LC3Ⅱ/Ⅰ表达的作用。
　　结论：SIRT1通过促进自噬抑制退变髓核细胞的凋亡，SIRT1通过磷酸化Erk1/2信号发挥调节人退变髓核细胞自噬的功能。

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前言

椎间盘髓核细胞的凋亡是椎间盘退变的主要原因

自噬可能抑制退变椎间盘髓核细胞凋亡，促进细胞存活

SIRT1可抑制椎间盘髓核细胞的凋亡

SIRT1可能通过促进椎间盘髓核细胞的自噬抑制凋亡

参考文献

第一部分人椎间盘髓核组织分离、鉴定及髓核细胞培养

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分自噬活性在正常人椎间盘髓核细胞及退变髓核细胞中的表达及意义

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 SIRT1调控自噬对人退变髓核细胞凋亡的影响及分子机制研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

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全文总结

文献综述: 椎间盘退变机制及治疗进展

致谢

攻读博士期间发表的论文及参加申报的课题